肉与肉制品中四环素族抗生素残留量的检验！

 

 

1、适用范围

 

本方法适用于肉和肉制品中四环素族抗生素残留量的检验

 

2、原理概要

 

四环素族 (四环素 土霉素 金霉素) 抗生素具有很强的抑菌作用。 在接有特定微生物的平板培养基上放入牛津杯， 在牛津杯内加满试样溶液 培养后测量抑菌圈的大小。

 

3、主要仪器和试剂与培养基

 

3.1  试剂：

3.1.1  磷酸盐缓冲液(pH4.5)

称取磷酸二氢钾 13.6g， 溶解于蒸馏水中， 定容到 1000mL， 高压灭菌 115，30min 冷却后置4 冰箱内保存。

3.1.2  生理盐水称取氯化钠8.5g溶解于1 000mL蒸馏水中， 高压灭菌115 30min。

3.1.3  盐酸 0.1mol/L溶液

3.1.4  标准四环素原液： 精确称取四环素 50mg， 用0.1mol/L 盐酸1 mL 溶解， 用水定容到 1 000mL， 在 4 冰箱中可保存一周。

 

3.2  培养基

3.2.1  菌种培养基

胰蛋白胨           10.0g

牛肉膏             5.0g

氯化钠             2.5g

琼脂               14.0- 16.0g

蒸馏水             1 000mL

将以上成分加热溶解， 高压灭菌 121 15min 最终pH6.5± 0.1

3.2.2  检定用培养基

胰蛋白胨    6.0g

牛肉膏      1.5g

酵母膏      3.0g

琼脂        14.0 -16.0g

蒸馏水      1 000mL

将以上成分加热溶解 高压灭菌 121 15min 最终pH5.8± 0.1

 

3.3  仪器

3.3.1  培养皿： 内径90mm,底部平整光滑 ，具陶质盖。

3.3.2  牛津杯： 内径6 ±0.1mm ，外径7.8 ±0.1mm 高度10± 0.1mm

3.3.3  游标卡尺 ：测量抑菌圈直径用

3.3.4  均质器

3.3.5  离心机

3.3.6  恒温水浴

3.3.7  恒温培养箱

3.3.8  电热干烤箱170 ±0.1

 

4、过程简述

 

4.1  检样液的制备

称取试样10.0g 加入0.1mol/L磷酸缓冲液 20mL，小心搅匀放置60min 然后于均质器中均质 (3000- 6000r/min)1min， 经4 000r/min离心10min， 其上清液为检样液。

 

4.2  菌液和检定用平板的制备

4.2.1  菌液的制备

菌种： 蜡样芽孢杆菌 (Bac cereus ATCC 11778) 由卫生部药品生物制品检定所提供。

将菌种移种于盛有300mL菌种培养基的克氏瓶中， 于30 培养箱中培养 7天。镜检芽孢数达到 85 %以上， 用生理盐水 25mL 洗下菌苔， 置 65 恒温水浴中加热30min， 离心(2000r/min)20min 弃去上清液 ，如此重复洗涤芽孢悬液三次。 再置于65 恒温水浴加热 30min ，然后取生理盐水50mL制成芽孢悬液。 置4 冰箱中可保存一个月

4.2.2  蜡样芽孢杆菌悬液用量的测定

在实际检定前先试几个平板， 即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用培养基中，使0.05ug/mL浓度的标准四环素溶液可产生 12mm以上的清晰 、完整的抑菌圈作为最适芽孢用量。 一般用量为每 100mL检定用培养基内加芽孢悬液0.5- 1.0mL ，1.0mL菌悬液中含芽孢数约为 106

4.2.3  检定用平板的制备

将适量芽孢悬液加入溶化后冷却至 55- 60 的检定用培养基中混匀。 每个平皿内加入培养基6mL， 前后摇动平皿， 使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平皿表面，置水平位置上盖上陶质盖， 待凝固后， 于每个平板的培养表面放置6个牛津杯， 使牛津杯在半径为2.8cm的圆面上成60度角的间距。所用平板须当天制备。

 

4.3  检定

4.3.1  标准曲线的绘制

四环素稀释液 取原液用 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释成0.025、 0.050、 0.100、0.200、 0.400、 0.800u g/mL 的标准溶掖 (当天用当天稀释)。

取检定用平板18个 ，分成6组， 每组3个平板作为平行试验。 第一组于每个平板的6个牛津杯中分别加满 0.025u g/mL的标准溶液作为对照组。 第二到第六组于每个平板上的6个牛津杯中， 间隔加满0.200u g/mL的标准溶液作为参考。 各组余下的牛津杯， 根据组别顺序依次加满 0.050 、0.100 、0.200、0.400 、0.800 ug/mL的标准溶液 ，经培养后 ，以各组抑菌圈直径的校正平均值绘制标准曲线。 抑菌圈直径校正值 (mm) 等于2 -6组 (0.200ug/mL) 抑菌圈直径的平均值减去各组抑菌圈直径平均值。 用此校正值校正 0.050、 0.100 、0.200 、0.400 、0.800 ug/mL标准溶液的抑菌圈直径平均值.。

校正后的值 ，包括 0.200ug/mL 浓度的平均值在半对数坐标纸上作图, 以抑菌圈直径为横坐标 (算术级), 以浓度为纵坐标 (对数级) 通过下列公式绘出标准曲线

L = (3a +2b+ c- e)/5

H = (3e+ 2d+ c- a)/5

式中： L—标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径； a b e相应浓度是 0.050、 0.100、0.800u g/mL。

H —标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径； a d e相应浓度是 0.050、 0.400 、0.800ug/mL

c—参考浓度(0.200u g/mL)的 45个抑菌圈直径的平均值。

4.3.2  试样中四环素族抗生素残留量的检定

每份试样取 3个检定用平板， 在每个检定用板上， 间隔的 3个牛津杯内加满四环素标准参考浓度溶液。 另外3个牛津杯加满被检试样液， 将陶质盖重新盖好， 置30 ±1 培养箱中， 培养 17± 1h 除去牛津杯翻转平板， 精确的测量产生的抑菌圈直径 (精确到 0.1mm)。 分别求出 3个检定用平板上参考浓度和被检试样抑菌圈直径数值校正后，从四环素标准曲线上查出被检试样中四环素的含量。

 

5、结果计算

从标准曲线上查出被检试样液的抗生素残留量， 乘以稀释倍数， 结果以 mg/kg计算。

 

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