犬巴贝斯虫PCR试剂盒的参考值与检验方法及应用！

 

 

一、背景

 

犬巴贝斯虫PCR试剂盒针对犬巴贝斯虫的基因组高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含犬巴贝斯虫基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

 

二、犬巴贝斯虫PCR试剂盒检验方法

 

1、试剂准备（试剂准备区）

 

a.计算当次实验所需要的反应数，从-20以下冰箱保存的试剂盒中取等量8联PCR反应管（内装有PCR反应液）,平衡至室温；预留一管作为阴性对照一管作为阳性对照。

 

b.将实验所需的8联PCR反应管转移至样本处理区。

 

2、样本准备（样本处理区）

 

用QIAGEN、Roche公司DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。

 

3、加样

 

a.取出8联PCR反应管试剂，瞬时离心以去除管壁附着液体。

 

b.打开反应管管盖，在液封层上（切勿插入底部）加入5μL处理好的样本重悬液；阴性对照和阳性对照管则各加5μL阴性对照或阳性对照品；

 

c.盖好PCR反应管盖，瞬时离心以去除管壁附着液体。

 

d.记录模板加样顺序。将PCR反应管转移到PCR扩增区进行PCR检测。

 

4、PCR（PCR扩增区）

 

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

 

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

 

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。

 

三、犬巴贝斯虫PCR试剂盒参考值

 

1、试剂盒有效性判定：

 

（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

 

（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

 

2、标本结果判定：

 

（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

 

（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

 

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

 

四、应用

 

犬巴贝斯虫PCR试剂盒针可以用于犬巴贝斯虫套式PCR检测方法的建立与应用：

 

巴贝斯虫是一类蜱传性寄生于红细胞内的血液原虫，能对各种家畜和人造成严重危害。临床上表现出贫血、发热、黄疸、血红蛋白尿等。随着生物技术的发展，目前已经建立了多种用于检测巴贝斯虫的方法，然而各种方法各有利弊，需要更敏感、快速、简单的诊断方法。

 

为此，本研究建立了套式PCR检测方法，并利用犬巴贝斯虫PCR试剂盒方法对豫西地区宠物犬只血液样品的血液原虫进行鉴定和流行病学调查。

 

犬的巴贝斯虫套式PCR检测方法的建立。本研究根据GenBank中收录的犬的巴贝斯虫18S rRNA基因序列，设计合成三组6对特异性诊断引物，利用实验室中原有阳性标准品选出最优组引物并建立套式PCR诊断方法。

 

利用犬巴贝斯虫PCR试剂盒套式PCR方法，对豫西地区(洛阳、平顶山、三门峡)各个县市共20个动物医院，15个大中型犬场(大于等于30只)的宠物犬进行调查，共采集犬血样2960份，捕捉媒介蜱虫813只。采用常规染色法、常规PCR法、套式PCR法进行检测，并计算犬的巴贝斯虫感染率。运用SZM系列体视显微镜进行形态学进行蜱虫观察，以鉴定传播犬巴贝斯虫病的媒介中蜱虫的种类。

 

将随机抽取的25份阳性样品送至华大基因科技服务有限公司进行测序，测序结果先用NCBI中的BLAST进行核酸同源性比较，用DNA Star5.0软件联合BioEdit软件进行系统分析构建进化树。

 

结果显示：最优一组引物PCR为上游:GGCTTTCGGTGATTCATA,下游:CCTTCCGTCAATTCCTTT,nPCR上游:TGGACCATTCAAGTTTCTG，下游:TCGTCTTCGATCCCCTA，用该组引物建立了套式PCR检测方法，扩增出外引物片段为858bp，内引物片段为658bp。该方法具有良好的特异性，用该方法不能扩增出附红细胞体，巴氏杆菌DNA等阴性样品；同时该方法具有较高多的灵敏度，最低能扩增出含10拷贝的阳性样品；

 

本研究调查发现，豫西地区宠物犬中犬的巴贝斯虫感染率为3.89%；随机抽取的25株致病株均为吉氏巴贝斯虫，致病株基因序列与美洲的18S rRNA(JX112784)同源性达100%，与亚洲株18S rRNA(KF878944/KF171474/AB478328/AB478330)同源性为98.8%；而在豫西地区犬的巴贝斯虫媒介以镰形扇头蜱为主(52.4%)，蜱虫带虫率为2.33%。

 

结论：本实验成功建立了犬巴贝斯虫套式PCR检测方法，可以用于犬巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查；

 

本研究发现豫西地区宠物犬的巴贝斯虫感染率较低，目前发现的病原株为吉氏巴贝斯虫，媒介以镰形扇头蜱为主。

 

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