荧光原位杂交(FISH)试剂盒的实验步骤及应用！

一、背景

荧光原位杂交(FISH)试剂盒原理是将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。

二、荧光原位杂交（FISH）的实验步骤

1.玻片处理

2.样品制备及其所涉及的试剂包括

3.取样及保存方法

4.样品固定

5.样品杂交

6.DAPI染色

7.封片荧光显微镜进行检测

三、FISH实验关键因素

1.温度

FISH实验温度直接影响探针杂交效率，实验中要求对相关仪器温度温差小于0.5，且实验环境温度要求20以上，一次实验操作不宜超过四张玻片，尽量保证实验温度一致。

2.湿度

FISH实验中适度同样直接影响杂交效率，尤其预杂交，杂交过程中需在湿盒中加入预杂交液/杂交液以保持环境湿度。

3.光照

FISH探针标记有荧光染料，光照影响荧光染料强度，实验过程中应注意避光，实验完成后尽快滴加荧光保护剂封片，并避光保存。

4.PH值

FISH实验对各试剂pH值要求严格，试剂pH值直接影响实验稳定性，每次实验试剂都需现用现配，精确调节pH值，且实验用水最好使用灭菌去离子水。

FISH技术优势：操作简单、检测快速、结果易观察、可检测多种类样品、空间定位准确、灵敏性和特异性高。

四、应用

FISH临床意义有指导临床治疗及药物选择、疾病的分期分型及预后判断、形态学检测的辅助手段。

例如在FISH技术在骨髓增生异常综合征中的应用与PRAME基因在骨髓增生异常综合征表达的研究中对MDS患者进行常规细胞遗传学显带分析(CC)和FISH检测,建立在MDS诊断过程中的规范化的FISH检测平台；比较FISH与常规细胞遗传学方法在检测MDS染色体异常克隆中的差异,探讨FISH在MDS诊断中的地位。同常规细胞遗传学显带分析(CC)不同,荧光原位杂交技术(FISH)不需要细胞培养,利用位点特异性基因探针可以检测间期细胞的克隆性染色体改变,并可以检测出10-20%左右核型正常的MDS的异常克隆。应用FISH技术,可以提高MDS患者染色体异常检出率,为诊断和治疗提供帮助。

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