大鼠一氧化氮合成酶(NOS)ELISA试剂盒的检测与应用！

一、背景

大鼠一氧化氮合成酶(NOS)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清,血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。

原理：本试剂盒采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠NO单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的NO与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠NO，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，NO浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中NO浓度。

二、准备试剂与收集血样

1、收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8保存48小时；更长时间须冷冻（-20或-70）保存，避免反复冻融。

2、标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成1000μM的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入1000μM的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3、10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4、洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

三、检测程序

1、加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37120分钟。

2、洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3、每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置3760分钟。

4、洗板：同前。

5、每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置3730分钟。

6、洗板：同前。

7、每孔加入底物工作液100ul，置37暗处反应15分钟。

8、每孔加入100ul终止液混匀。

9、30分钟内用酶标仪在45 0nm处测吸光值。

四、结果计算与判断

1、所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2、以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0μM为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3、根据样品OD值在该曲线图上查出相应NO含量。

五、应用

用于诱导性一氧化氮合成酶iNOS在大鼠穿透性角膜移植中的表达及意义研究：

iNOS有可能参与了角膜移植排斥反应及新生血管形成的过程。

方法：随机选取健康成年雌性Wistar大鼠15只为供体,雄性SD大鼠30只为受体,做异体角膜移植为实验组,另取18只做自体角膜移植为移植对照组。余3只SD大鼠（6眼）作为正常对照组。术后,每日于裂隙灯显微镜下观察角膜以及眼前段组织的变化。于术后第1d,3d,7d,14d,21d,28d各随机处死5只异体角膜移植实验组大鼠,2只自体角膜移植对照组大鼠正常组3只大鼠于实验结束前处死,取角膜标本行石蜡切片、苏木素-伊红（hemotoxylin and eosin,HE）染色观察新生血管生长和炎性浸润情况；以免疫组织化学方法检测角膜移植片iNOS的表达水平。每张切片角膜中央区随机取5个400倍视野,使用计算机图像分析软件计算平均灰密度值,取其平均值作为该标本各检测指标的表达率。

结果：（一）角膜新生血管及植片存活情况异体角膜移植术后1d可见明显水肿,术后7d可见角膜新生血管长入植片,14d为高峰,21d以后逐渐消退。自体对照组新生血管及排斥反应均未及异体移植组明显。

（二）组织病理学检查术后1天时异体角膜移植实验组切片可见轻度水肿,少量炎性细胞浸润,7d时可见大量炎性细胞及新生血管,14d时达到高峰,21d以后炎性细胞减少新生血管萎缩。自体移植对照组无论是炎性细胞数还是新生血管数量均未及异体移植实验组。

（三）免疫组织化学iNOS在正常对照组大鼠角膜上皮层及基质层仅有少量表达,术后各时间点自体、异体角膜移植实验组均较正常对照组表达明显增强（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000,F=236.453、132.785、144.727、326.412、163.883、53.116、25.868、140.831、123.902、64.913、264.474、378.131）,表达范围主要在基质层炎性细胞、角膜上皮细胞及新生血管内皮细胞胞浆内。异体移植实验组及自体移植对照组均在术后第14d表达最强烈。3d后异体移植实验组iNOS的表达较同期自体移植对照组明显增强（P=0.002、0.025、0.042、0.027,0.034,F=19.912、7.804、6.043、8.645、6.527）。结论iNOS在大鼠异体角膜移植模型中的表达增加,并参与了大鼠异体角膜移植排斥反应及新生血管形成的过程。