大鼠外周血中性粒细胞的应用及培养操作规程！

一、背景

大鼠外周血中性粒细胞采用密度梯度离心法制备而来，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

外周血中性粒细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。单核细胞（Mo）是在血液中循环的未成熟的吞噬细胞。作为一种递呈抗原的免疫细胞，他们能吞噬和降解微生物和颗粒物质。单核细胞能够分化为几类不同的细胞类型。单核细胞最常见的应用是体外分化成为单核细胞来源的树突状细胞（moDC），巨噬细胞和成骨细胞以及它们作为吞噬免疫细胞在免疫学和感染生物学方面的作用。

二、细胞操作

1、取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3、细胞传代

1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按1:2-1:3适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察；之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

三、应用

用于大鼠外周血中性粒细胞在较长细菌刺激时期内的生物学反应特性及其意义研究：

研究了较长细菌刺激时期内（约300分钟）大鼠外周血中性粒细胞的生物学反应特性及其意义。主要采用细胞耗氧、化学发光等检测方法研究系统氧耗变化，活性氧物质生成反应，用细菌培养方法研究中性粒细胞抑菌杀菌机制，采用细胞培养、染色、光学显微镜形态学方法研究测定中性粒细胞吞噬功能。

在细菌与外周血混合后，血细胞（中性粒细胞）系统产生两个相互分离的ROS生成峰，即ROS峰和ROS峰。ROS峰在刺激后立即出现，30分钟以内消失，峰值小，伴有耗氧增强；ROS峰在刺激后60分钟左右出现，持续时间可达150分钟以上，峰值明显高于峰，不伴耗氧现象。

ROS峰的大小与细菌浓度成正比，其峰值出现时间无明显改变；ROS峰随细菌浓度增加，其峰值出现时间明显提前，峰值逐渐增加。整个历时近300分钟的反应过程中，用辣根过氧化物酶未测出细胞外发光信号，表明整个过程中产生化学发光的中性粒细胞细胞膜通透性无明显变化，其发光反应主要来自细胞内生物化学反应过程。

显然，ROS峰和ROS峰具有明显不同的生物学活性，并且代表两类不同功能状态的细胞。用绿脓杆菌等进行的体外实验研究还发现，大鼠全血具有明显的抑菌杀菌作用，此作用与中性粒细胞直接相关，但与血浆成份无直接关系。全血抑菌杀菌过程可分成两个截然不同的阶段，即在ROS峰前期的快速抑菌杀菌期和其后的缓慢抑菌杀菌期。快速抑菌杀菌期中细菌灭活率高达90％左右，此作用在反应开始后3分钟内基本完成。

此时，中性粒细胞吞噬细菌的程度并不明显，吞噬细菌中性粒细胞的比例仅占总粒细胞的5％以下，显然，此间的抑菌杀菌现象与中性粒细胞的胞外作用机制有关。在缓慢抑菌杀菌期，中性粒细胞吞噬细菌的作用随反应时间延长而明显增强，在ROS峰之后（反应后200-250分钟），其吞噬率可达30％-60％。吞噬中性粒细胞的比例以及单位粒细胞吞噬细菌的数量随培养时间的延长而增加的程度与反应系统中活菌数量的减少幅度基本相似，因此，中性粒细胞的吞噬及胞内机制可能在缓慢抑菌杀菌期中起着重要的作用。