急性早幼粒细胞株的培养操作步骤与应用研究！

一、背景

急性早幼粒细胞株来源1989年第二次复发的急性早幼粒细胞白血病（APL；FAB命名法中的M3）患者的骨髓。

二、急性早幼粒细胞株培养步骤

1）复苏急性早幼粒细胞株细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）急性早幼粒细胞株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮急性早幼粒细胞株细胞，传代可参考以下方法：

1、收集急性早幼粒细胞株细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

2、可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

3）急性早幼粒细胞株细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

三、应用

急性早幼粒细胞株可以用于低剂量PRF诱导的人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞自噬与分化的作用机制：

探讨低剂量PRF诱导的NB4细胞自噬在NB4细胞生存及转归中的作用,利用自噬以及MEK/ERK相关信号分子的变化等揭示可能的分子机制。

研究方法：

1、低剂量PRF对NB4细胞自噬表达的影响NB4细胞经梯度浓度(0、5、10、15μg/ml)PRF处理48h,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测自噬相关蛋白LC3-、Beclin1的表达变化;qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)技术检测自噬相关基因ATG5、Beclin1的表达变化;10μg/mlPRF作用48h后,单丹磺酰尸胺(MDC)染色及透射电镜技术检测NB4细胞中自噬小体的变化。

2、自噬在低剂量PRF诱导NB4细胞分化的作用NB4细胞经3MA(5mM)预处理1h后,再给予PRF(10μg/ml)作用48h,采用WB检测自噬相关蛋白LC3-、Beclin1以及PML-RARα融合蛋白的表达变化;采用瑞士-吉姆萨染色(Giemsa-Wright’s staining)检测NB4细胞形态学改变情况;采用流式细胞术(FCM)来检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达阳性率以及细胞改变。

3、低剂量PRF诱导NB4细胞自噬及分化可能的分子机制NB4细胞经10μg/mlPRF作用48h后,运用WB检测MEK和ERK1蛋白的表达水平。采用该通路抑制剂SCH772984(10μM)预处理NB4细胞1h后,再给予10μg/mlPRF作用48h,WB检测ERK1、LC3-、PML-RARα蛋白表达的变化;MDC染色和Giemsa-Wright’s staining观察NB4细胞中酸性自噬溶酶体和细胞形态学的变化;运用FCM检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达以及细胞周期变化;qRT-PCR技术分析不同浓度梯度(0、5、10、15μg/ml)PRF作用48h后的NB4细胞以及抑制剂SCH772984(10μM)预处理后ERK1、LC3-、PML-RARα在mRNA水平的表达。

研究结果：

1、PRF体外可诱导NB4细胞自噬。PRF(10μg/ml)药物作用48h后自噬水平提升明显,自噬相关蛋白LC3-及Beclin1的表达升高;ATG5及Beclin1在mRNA水平表达增多;PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达减少;细胞中自噬小体的数量增多。

2、自噬抑制剂3MA(5mM)预处理1h,再予以PRF(10μg/ml)作用48h后,自噬相关蛋白LC3-、Beclin1的表达下调,融合蛋白PML-RARα的表达下调,Beclin1、LC3-、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;抑制NB4细胞向正常粒细胞分化的形态学也发生改变,阻断自噬也降低了PRF诱导的CD11b表达下降,抑制了细胞周期阻滞在G0/G1期的现象。

3、PRF(10μg/ml)作用NB4细胞48h后可显著上调MEK和ERK1的蛋白表达水平。通路抑制剂SCH772984(10μM)预处理1h后,10μg/ml PRF诱导的ERK1、LC3-的蛋白表达及PML-RARα的降解程度均受抑,Beclin1、LC3-、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;NB4细胞中酸性自噬溶酶体比例下降,抑制细胞形态改变,表面分化抗原CD11b表达下调,表明NB4细胞分化受阻。

结论：低剂量(10μg/ml)PRF通过激活MEK/ERK信号通路促进NB4细胞的自噬,引起致癌蛋白PML-RARα的降解,最终诱导NB4细胞向正常粒细胞分化。低剂量(10μg/ml)PRF诱导的NB4细胞自噬与分化之间的关系有待进一步通过体内实验验证。