Β-半乳糖苷酶染色试剂盒的操作步骤及应用！

 

一、背景

 

Β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时SA-β-Gal(senescence-associatedβ-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。

 

绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变会大，表达pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化(aging)的一种潜在原因。

 

本试剂盒可以用于培养细胞的衰老检测。贝博β-半乳糖苷酶染色试剂盒以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。本试剂盒仅染色培养细胞中的衰老细胞，对衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞等不会染色。

 

二、Β-半乳糖苷酶染色试剂盒操作步骤

 

染色工作液的配制方法如下：

 

试剂C：β-半乳糖苷酶染色液A 12.5ul

 

试剂D：β-半乳糖苷酶染色液B 12.5ul

 

试剂E：β-半乳糖苷酶染色液C 925ul

 

试剂B：X-Gal溶液50ul

 

注意：

 

1.使用聚丙烯容器，不能使用聚苯乙烯容器配置染色工作液。

 

2.对于聚丙烯容器和聚苯乙烯容器的简单的判定方法：聚丙烯容器可以高温高压灭菌；而聚苯乙烯容器不适合高温高压灭菌，一旦高温高压就会严重变形。

 

（一）Β-半乳糖苷酶染色试剂盒贴壁细胞染色：

 

1、对于6孔板中培养的贴壁细胞，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入1ml试剂A：β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。

 

【注】：对于其他类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。

 

2、吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞2-3次，每次3min。

 

3、吸除PBS或HBSS，每孔加入1ml染色工作液。以充分盖住样品为宜。

 

4、37孵育2h至过夜，直至样品显蓝色，一般2-3h会有蓝色出现，12-16h后达到最大显色。可以用parafilm或保鲜膜封住防止蒸发。以充分盖住样品为宜。

 

【注】：37孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

 

5、普通光学显微镜观察。

 

如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2mlPBS，4可保存数天；

 

或者加上封片液封片后，4可保存较长时间。

 

（二）Β-半乳糖苷酶染色试剂盒悬浮细胞染色：

 

1、离心收集细胞至1.5ml离心管内，用PBS或HBSS洗涤1次，加入1ml试剂A：β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。

 

【注】：固定时可以在摇床上缓慢摇动，以免细胞结团。

 

2、低速离心，吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞2-3次，每次3min。

 

3.低速离心、吸除PBS或HBSS，每管加入0.5~1ml染色工作液。

 

4.37孵育2h至过夜。直至样品显蓝色，一般2-3h会有蓝色出现，12-16h后达到

 

最大显色。可以用parafilm或保鲜膜封住防止蒸发。以充分盖住样品为宜。

 

【注】：37孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

 

5.取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或6孔板内，普通光学显微镜观察。

 

如不能及时观察计数，可以离心去除染色工作液，加入1mlPBS，4可保存数天；

 

如离心，取细胞用于涂片，加上封片液封片后，4可保存较长时间。

 

三、应用

 

Β-半乳糖苷酶染色试剂盒可以用于铁死亡在血管内皮细胞炎症和衰老中的作用及调节机制研究：

 

目的：

 

1、研究铁死亡在血管内皮细胞炎症损伤中的作用及其与血管内皮细胞炎症和细胞衰老的关系;

 

2、探究NRF2对血管内皮细胞铁死亡、炎症损伤及衰老的调控作用及机制;3.阐明NRF2介导的氧化还原稳态调节机制对氧化应激导致的血管内皮细胞损伤和铁死亡的适应性调节作用。

 

方法：

 

1、应用LPS处理HUVECs细胞,构建血管内皮细胞炎症损伤和衰老模型

 

(1)用不同剂量(0μg/m L,0.5μg/m L,1μg/m L,2μg/m L,4μg/m L和8μg/m L)的LPS处理HUVECs细胞24 h,明确最佳药物作用浓度后,用2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间(0 h,6 h,12 h,24 h和48 h),CCK8法检测胞活力;

 

(2)Western Blot检测2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间(0 h,1 h,3 h,6 h,9 h,12 h和24 h)后血管内皮细胞炎症相关蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α的表达;

 

(3)β-半乳糖苷酶染色检测在不同浓度(0μg/m L,1μg/m L,2μg/m L,4μg/m L)LPS以及2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间(0 h,12 h,24 h,48 h)后细胞衰老变化;Western Blot检测LPS对HUVECs内衰老蛋白p53、p21和p16表达的影响。

 

2、探究铁死亡在LPS诱导的血管内皮细胞炎症损伤和衰老中的作用

 

(1)2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间(0 h,1 h,3 h,6 h,9 h,12 h和24h),Calcein-AM探针和细胞铁检测试剂盒检测细胞内铁离子浓度,细胞微量还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞内GSH和MDA水平,DCFH-DA探针检测HUVECs内ROS水平,Mito Tracker标记细胞内线粒体,q RT-PCR和Western Blot检测铁死亡相关GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH m RNA和蛋白表达;

 

(2)铁死亡抑制剂(Fer-1)预处理HUVECs细胞3 h,后予以2μg/m L LPS处理HUVECs,分别检测细胞内铁离子、GSH、MDA、ROS和线粒体损伤情况,以及细胞铁死亡相关GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH m RNA和蛋白表达,进一步证实铁死亡参与LPS诱导的HUVECs炎症损伤过程;

 

(3)Western Blot检测Fer-1抑制铁死亡后LPS处理的HUVECs内HMGB1、IL-6和TNF-α炎症蛋白的表达;

 

(4)β-半乳糖苷酶染色检测Fer-1预处理HUVECs后LPS对细胞衰老的影响,Western Blot检测Fer-1预处理HUVECs后LPS诱导的HUVECs内p53、p21和p16衰老蛋白表达变化。

 

3、探究NRF2对血管内皮细胞铁死亡、炎症及衰老的调控作用及机制

 

(1)Western Blot和q RT-PCR检测LPS处理的HUVECs在抑制铁死亡前后NRF2总蛋白、核蛋白、浆蛋白以及NRF2 m RNA表达情况,同时使用免疫荧光染色观察NRF2入核情况,验证抑制铁死亡前后LPS对NRF2核内移的影响;

 

(2)通过NRF2过表达质粒和NRF2抑制剂ML385建立NRF2高表达和低表达模型,检测过表达和抑制NRF2后LPS对HUVECs的细胞活力、细胞内铁离子、GSH和MDA水平、线粒体形态和ROS水平以及铁死亡相关蛋白GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH表达影响,探讨NRF2对LPS诱导的HUVECs铁死亡的调控作用;

 

(3)Western Blot检测过表达和抑制NRF2对LPS诱导的HUVECs炎症蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α表达水平的影响;

 

(4)β-半乳糖苷酶染色检测过表达和抑制NRF2对LPS诱导的HUVECs衰老的影响,Western Blot检测过表达和抑制NRF2后LPS诱导的HUVECs内衰老蛋白p53、p21和p16表达变化。