小鼠肥大细胞瘤细胞的背景与应用及培养操作！

一、背景

小鼠肥大细胞瘤细胞源自DBA/2小鼠的肥大细胞瘤；可吞噬乳胶微球，但不吞噬酵母聚糖或卡介苗，没有抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。硫酸右旋糖酐、LPS或PPD不能抑制细胞生长；产生溶菌酶；鼠痘病毒阴性。

二、小鼠肥大细胞瘤细胞培养操作

1）复苏小鼠肥大细胞瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）小鼠肥大细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）小鼠肥大细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠肥大细胞瘤细胞可以用于小鼠肥大细胞瘤P815细胞诱导BALB/c鼠产生特异性抗肿瘤免疫效应：

采用小鼠肥大细胞瘤P815细胞作为抗原皮下免疫BALB/c小鼠,探讨其是否可诱导BALB/c小鼠产生较强的、针对P815细胞的特异性免疫应答,为肿瘤疫苗设计筛查抗原提供基础。

方法小鼠肥大细胞瘤P815细胞经尾静脉注入BALB/c小鼠,实验按每只小鼠注入细胞数分为1×107/只组、5×106/只组、2.5×106/只组、1×106/只组、5×105/只组、1×105/只组和溶剂(RPM 11640培养液)对照组,每组6只小鼠。观察各组小鼠的生存状态、体重及肝肺脾(重量、形态、病理)、血涂片、骨髓涂片、白细胞及血小板计数变化。

皮下注入P815细胞对BALB/c小鼠形成肥大细胞瘤/白血病的影响实验分为4组,即P815细胞组、米托蒽醌处理的P815细胞组、L1210细胞组、溶剂对照组,每组6只BALB/c小鼠,分别于双侧臀部皮下注入P815细胞悬液(PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只)、0.1ug/ml米托蒽醌作用12小时的P815细胞悬液(PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只)、L1210细胞悬液(PBS液配制,0.5ml/只,细胞数5×106/只)和PBS液0.5ml/只。一周后,4组小鼠均尾静脉注入P815细胞悬液1.5×106/只(RPMI1640培养基配制,0.15ml/只)。

观察各组小鼠生存时间、血涂片、体重及肝肺脾变化,评定各组小鼠形成肥大细胞瘤/白血病情况(观察期限为尾静脉注入P815细胞后3个月)。

皮下注入P815细胞诱导BALB/c鼠产生特异性抗肿瘤免疫效应实验分为2组。随机抽取第二章实验中尾静脉注入P815细胞后未死亡的BALB/c小鼠3只设为实验组,新购买的3只BALB/c小鼠设为对照组。对照组小鼠双侧臀部皮下注入0.5mlPBS液一周后,和实验组小鼠一起,颈椎脱臼法处死。无菌取脾脏,制备脾细胞悬液。乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测两组小鼠脾细胞分别对P815细胞、L1210细胞的杀伤率。观察两组小鼠脾细胞对P815细胞克隆形成的影响。实验各重复3次。

各实验数据用均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS13.0软件进行统计分析,各组小鼠体重、肝脾肺重、白细胞和血小板计数采用单向方差分析比较,方差齐时用LSD法行多重比较,方差不齐时用校正F值的Welch法检验及Dunnett T3法行多重比较。各组小鼠生存时间用Kaplan-Meier法行生存分析。两组脾细胞对P815细胞、L1210细胞的杀伤率和克隆影响采用两独立样本t检验和两因素两水平析因设计资料的方差分析进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。