人多发性骨髓瘤细胞的背景与应用及培养操作！

一、背景

人多发性骨髓瘤细胞是从一位对类固醇疗法产生抗药性的多发性骨髓瘤患者的外周血中建立的。MM.1R对地塞米松耐药。近缘细胞系MM.1S也是从MM.1中分离出来的，但对地塞米松敏感。

多发性骨髓瘤是在一种白细胞（称作浆细胞）中形成的癌症。健康的浆细胞通过产生识别并攻击微生物的抗体辅助您对抗感染。

在多发性骨髓瘤中，癌性浆细胞聚集在骨髓内并挤走健康的血细胞。癌细胞非但不产生有益的抗体，反而产生可能引起并发症的异常蛋白。

多发性骨髓瘤并不一定需要立即治疗。如果多发性骨髓瘤生长缓慢且没有引起体征和症状，医生可能建议密切监测而非立即治疗。对于需要治疗的多发性骨髓瘤患者，多种治疗方案可用于辅助控制病情。

二、人多发性骨髓瘤细胞培养操作

1)复苏人多发性骨髓瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL人多发性骨髓瘤细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第三天换液并检查细胞密度。

2)人多发性骨髓瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人多发性骨髓瘤细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02TA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37培养箱中消化1-3min（视细胞消化情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将人多发性骨髓瘤细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人多发性骨髓瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人多发性骨髓瘤细胞可以用于NUPR1基因对人多发性骨髓瘤细胞自噬及凋亡的影响及机制研究：

研究NUPR1基因及自噬标记物在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者骨髓的表达。构建慢病毒沉默NUPR1基因,转染MM细胞株,创新性探讨NUPR1基因对MM细胞自噬及凋亡的影响及机制。

方法：

1、收集初诊MM患者骨髓标本28例,健康志愿者骨髓标本10例,同时收集上述患者临床信息。提取骨髓标本单个核细胞,检测骨髓NUPR1和自噬标记物mRNA相对表达量,分析NUPR1、自噬标记物及患者临床特征的相关性。

2、体外细胞实验:构建靶向NUPR1基因shRNA慢病毒及阴性对照慢病毒,转染人MM细胞株(U266和RPMI 8226)。实验分为三组:未转染病毒空白组(Blank)、阴性对照慢病毒转染组(NC-LV)和NUPR1shRNA慢病毒转染组(NUPR1-LV)。应用流式细胞术检测转染效率,qRT–PCR及Western blot验证NUPR1沉默效果。透射电子显微镜(TEM)和单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测NUPR1沉默对MM细胞自噬活性的影响;流式细胞术和Hoechst染色评估各组细胞凋亡情况;Western blot评估MM细胞自噬、凋亡相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达情况。以自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)及PI3K抑制剂LY294002处理MM细胞,Western blot检测相关蛋白表达水平。

结果：

1、MM患者骨髓单个核细胞NUPR1基因表达及自噬活性呈高水平:NUPR1基因及自噬标记物(Beclin1、ATG5和ATG12)mRNA水平在初诊MM患者骨髓标本中表达增加,且NUPR1与Beclin1、ATG5和ATG12基因水平呈正相关关系。骨髓NUPR1高表达与患者临床分期(RISS和D-S分期)?血钙水平和骨髓浆细胞数比例呈正相关,与血红蛋白水平负相关。

2、NUPR1 shRNA慢病毒成功转染人MM细胞:流式细胞术示NC-LV和NUPR1-LV组细胞转染率均达80%以上,qRT–PCR及Western blot证实NUPR1沉默效果显著。

3、沉默NUPR1导致MM细胞自噬活性降低:TEM结果示NUPR1-LV组自噬小体较Blank和NC-LV组明显减少,MDC也显示NUPR1沉默组自噬颗粒减少,Western blot结果表明与Blank和NC-LV组相比,NUPR1-LV组LC3 II/LC3 I比值和Beclin1表达下调,P62蛋白表达上调。

4、沉默NUPR1激活MM细胞凋亡:流式细胞术检测显示NUPR1-LV组凋亡率较NC-LV组明显增加,Hoechst染色也显示NUPR1-LV组凋亡细胞增加,且NUPR1沉默后MM细胞cleaved caspase3和BAX蛋白表达升高,BCL2表达降低。

5、NUPR1沉默通过抑制自噬活性促进MM细胞凋亡:RAPA处理后,Western blot发现NUPR1-LV组细胞自噬水平增加、凋亡减少;而3-MA干预后,NUPR1沉默组细胞自噬受抑、凋亡增加。

6、NUPR1通过PI3K/AKT/mTOR通路影响MM细胞自噬及凋亡:沉默NUPR1后MM细胞总PI3K、AKT、mTOR表达无明显变化,而磷酸化PI3K、AKT、mTOR表达增加;PI3K抑制剂LY294002处理引起细胞自噬活性增加凋亡水平降低。