支原体染色检测试剂盒的操作步骤及应用！

一、背景

支原体染色检测试剂盒是利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

二、支原体染色检测试剂盒操作步骤

贴壁细胞：

1、被检细胞接种于无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为1-2×104。同时，接种正常无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。

2、5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min，

3、吸去固定液，晾干。

4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞），37避光放置15-20min或室温静置20～30min。

5、吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml灭菌超纯水洗涤三次，直接风干。风干后加入一滴封片液，并以盖玻片覆盖。

6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。

悬浮细胞：

1、收集需检测的细胞，1500rpm，5min。

2、将收集的细胞涂片于载玻片上，再加1ml的固定液，静置20min。

3、吸去固定液，晾干。

4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液须覆盖全部被检细胞），37避光放置15～20min或室温静置20～30min。

5、吸去Hoechst 33258工作液，用无菌水洗涤玻片3次，直接风干。风干后加入一滴封固液，并以盖玻片覆盖。

6、荧光显微镜观察。用紫外激发光激发，观察细胞周围是否有蓝色荧光小点或串珠状荧光小点。

支原体染色检测试剂盒结果判断：

阴性：仅见细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。

阳性：除细胞外，细胞周围可见大量的大小均一的荧光着色颗粒。

三、应用

支原体染色检测试剂盒可以用于细胞库支原体检测体系以及支原体去除方法的建立：

生命科学迎来了繁荣发展的时代。从生物石油到药品、医疗,无一不和生命科学息息相关。细胞株作为生命科学研究的重要材料显得尤为重要。无污染的细胞株是得到可靠实验数据的前提。作为国家级细胞株保藏中心,监测细胞株的质量一直是本细胞库重点工作之一。

细胞株的微生物污染源一般有细菌、真菌、支原体。细菌和真菌污染细胞培养物时导致培养基变色,镜下可以看到菌体。但细胞株感染支原后培养基通常不会有颜色变化,更不能在普通显微镜下观察到。支原体会影响培养细胞的各项参数,甚至导致细胞株死亡,因此建立细胞库支原体检测体系以及支原体去除方法非常必要。

本研究结合本库自身情况选用最易操作的三种方法:DNA染色、直接培养法、PCR,对本细胞库保藏的常用的100种细胞株进行支原体检测。根据各不同方法的优缺点建立适用于本细胞库的支原体检测流程体系:入库前PCR试剂盒预检、入库后三项全检、日常两项监控、供应中自建PCR检测。

在有支原体污染的细胞株中选取珍贵、稀有、且国内研究者急需求的细胞株为研究对象,同时使用BM-Cyclin和MC-210两种药剂去除支原体。在支原体去除后的一周、一个月、一年的时间段里,重复检测支原体污染,用以评价两种药剂效果和优缺点。通过对比,最终确定BM-Cyclin为细胞库去除支原体污染的首选药剂。

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