D283 Med细胞的复苏与传代及冻存操作流程！

一、背景

D283 Med细胞是由Friedman等人于1985年建系，源自一名6岁患有神经管细胞瘤有腹腔转移的白人男性小孩的腹水细胞。

二、D283 Med细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、D283 Med细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）D283 Med细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到D283 Med细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察D283 Med细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37）的完全培养基，继续培养。

2、D283 Med细胞传代

1）待D283 Med细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使D283 Med细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集D283 Med细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、D283 Med细胞冻存

1）按照D283 Med细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80过夜后，转入液氮长期保存。

三、应用

D283 Med可以用于ATXN1在髓母细胞瘤和ALDH1在食管癌干性维持与侵袭中的作用及其分子机制研究：

本研究主要包括以下两部分内容：第一部分ATXN1对髓母细胞瘤干性与侵袭特性的调控作用及其分子机制髓母细胞瘤(medulloblastoma)是儿童最常见的恶性脑肿瘤，临床预后差。使用成球培养法从髓母细胞瘤中分离/富集了髓母细胞瘤干细胞，并发现其具有高侵袭性及高成瘤能力的特性。

通过本课题组在肺癌和胃癌中对成球细胞与普通贴壁细胞的基因表达谱芯片分析，筛选出ATXN1这个差异性表达的基因并发现其在髓母细胞瘤成球细胞中高表达。通过免疫组化染色发现髓母细胞瘤中ATXN1的表达与其临床预后密切相关，因此进一步研究了ATXN1在调控髓母细胞瘤自我更新及侵袭中的作用及可能的分子机制。

本部分实验主要方法、研究结果及结论如下：

1、髓母细胞瘤原代细胞的培养及细胞系的建立。为了更好的了解髓母细胞瘤细胞的生物学特性并满足实验研究的需要，收集了5例髓母细胞瘤原代标本进行细胞培养；并且成功建立了一株发生于成人的髓母细胞瘤细胞系。对建系后的细胞采用光镜、电镜、免疫组化、流式细胞术、染色体分析和移植瘤等实验对细胞株生物学特性进行了研究。

2、使用成球培养法成功分离/富集髓母细胞瘤干细胞，并进行了生物学特性鉴定。

(1) 用无血清的干细胞培养基对髓母细胞瘤细胞Daoy、ons76和D283培养，三个细胞均能成球生长；

(2) 实时定量PCR检测发现细胞球细胞(sphere cells,SC)较单层培养细胞(monolayer cell，MN)高表达干性相关基因Bmi1、Nanog、Nestin、Oct4和Sox2及基质金属蛋白酶MMP2、MMP7、MMP9和MMP13；

(3) 免疫荧光检测表明Daoy-SC高表达Nestin、Sox2和CD133，低表达GFAP、MBP和β-tubulin；

(4) Daoy-SC细胞于含血清的培养基中培养时则高表达GFAP、MBP和β-tubulin，不表达Nestin、Sox2和CD133；

(5) Transwell实验表明Daoy-SC比Daoy-MN具有更强的侵袭能力；

(6) 裸鼠皮下移植瘤实验表明同数量级的Daoy-SC比Daoy-MN细胞具有更强的肿瘤形成能力。上述结果从干性和侵袭相关基因的表达、多向分化能力、侵袭和成瘤能力等几个方面证实了成球生长的细胞具有TICs的特性。

3、通过基因芯片筛选出在胃癌和肺癌成球细胞中均高表达分子ATXN1，发现ATXN1在调控髓母细胞瘤的迁移、侵袭，自我更新及成瘤能力中均具有重要作用。

(1) 实时定量PCR检测发现ATXN1在髓母细胞瘤干细胞中高表达；

(2) 利用慢病毒干扰Daoy和ons76细胞ATXN1的表达后，可以显著抑制髓母细胞瘤细胞的迁移、侵袭、克隆形成和成瘤能力；

(3)过表达ATXN1则增强髓母细胞瘤细胞D283的侵袭和成瘤能力。