C2C12鼠成肌细胞的培养操作步骤及应用！

一、背景

C2C12是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆。C2C12细胞分化很快，容易形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白2(BMP-2)处理C2C12细胞，会导致C2C12细胞的分化途径从成肌细胞转换为成骨细胞。

C2C12作为研究肌肉理想的细胞模型，在实验研究中常诱导其分化为多核肌管。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，它是通过一种高度协调的序列程序来产生成熟的骨骼肌的过程。

二、C2C12细胞系培养操作

1）复苏C2C12细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）C2C12细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗C2C12细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察C2C12细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）C2C12细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1.C2C12细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

C2C12可以用于MOTS-c通过SIRT3诱导C2C12成肌细胞UPRmt的机制研究：

MOTS-c是最近发现的一种由线粒体12S r RNA开放阅读框编码的短肽,其主要作用的靶器官是骨骼肌,并且对衰老和SIRT3都具有一定调节作用。

本实验将通过利用鱼藤酮、SIRT3-si RNA、SIRT3过表达和外源性MOTS-c对C2C12成肌细胞进行干预,验证:1)SIRT3是否参与调控骨骼肌UPRmt生物效应;2)SIRT3是否能独立诱发UPRmt;3)MOTS-c是否通过SIRT3诱导UPRmt。研究方法:本研究实验对象为C2C12成肌细胞,研究共分为三部分。

第一部分验证SIRT3是否参与调控骨骼肌UPRmt生物效应,实验分组为空白对照组(C)、SIRT3-si RNA组(si RNA)、鱼藤酮干预组(ROT)、鱼藤酮+SIRT3-si RNA组(ROT+si RNA);

第二部分验证SIRT3是否能独立诱发UPRmt,实验分组为空质粒组(C)、SIRT3过表达质粒组(SIRT3-OE)、鱼藤酮阳性对照组(ROT);

第三部分验证MOTS-c是否通过SIRT3诱导UPRmt,实验分组为空白对照组(C)、SIRT3-si RNA组(si RNA)、外源性MOTS-c孵育组(MOTS-c)、MOTS-c+SIRT3-si RNA组(MOTS-c+si RNA)。用DCFH-DA探针法检测ROS生成水平。

用JC-1探针法检测线粒体膜电位水平ΔΨ。用Western-blotting实验方法检测UPRmt的氧化损伤通路中Fox O3a、SIRT3和SOD2;UPRmt的线粒体基质通路c-Jun、CHOP和HSP60;UPRmt的线粒体膜间腔通路AKT、NRF1和OMI以及对MOTS-c相关通路AMPK的蛋白表达水平。

研究结果：

(1)SIRT3是C2C12成肌细胞UPRmt激活的必要条件之一与C组比较,ROT组SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP、HSP60、AKT、NRF1和OMI蛋白表达水平都显著性升高(P<0.05),Fox O3a蛋白表达水平显著性升高(P<0.01)。与ROT组比较,ROT+si RNA组HSP60、AKT和NRF1蛋白表达水平显著性降低(P<0.05),Fox O3a、SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP和OMI蛋白表达水平显著性降低(P<0.01)。

(2)单纯过表达SIRT3能激活C2C12成肌细胞UPRmt与C组相比,SIRT3-OE组Fox O3a、SOD2、c-Jun、CHOP、AKT、NRF1和OMI的蛋白表达水平都显著性升高(P<0.05)。

(3)外源性MOTS-c通过SIRT3途径激活C2C12成肌细胞UPRmt与C组比较,MOTS-c组Fox O3a、SIRT3、SOD2、c-Jun、CHOP、HSP60、AKT、NRF1、OMI和AMPK蛋白表达水平都显著性提高(P<0.05)。与MOTS-c组相比,MOTS-c+si RNA组c-Jun、CHOP、AKT、AMPK蛋白表达水平显著性降低(P<0.05),Fox O3a、SIRT3、SOD2、HSP60、NRF1和OMI蛋白表达水平显著性降低(P<0.01)。

研究结论：

1、SIRT3是C2C12成肌细胞UPRmt激活的必要条件之一。

2、单纯过表达SIRT3亦可激活C2C12成肌细胞UPRmt。

3、外源性MOTS-c可通过SIRT3途径激活C2C12成肌细胞UPRmt。