溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基的应用及使用方法！

一、背景

溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基用于压力蒸气消毒过程监测指示菌（嗜热脂肪杆菌芽孢）的培养及消毒效果测定。

嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。嗜热脂肪芽孢杆菌比较容易识别且对人体没有危害性，一般作为空间消毒的指示生物。

嗜热脂肪地芽孢杆菌营养细胞呈长杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞宽0．6～1.μm、长2.0～3.5μm，细胞壁为革兰阳性结构，但染色可在阳性和阴性之间变化。芽孢呈椭圆或柱状、端生或次端生，孢囊膨胀或不膨胀，无伴孢晶体形成。最佳生长温度为56～60，最高生长温度为65～75，最低生长温度为30～45，需氧或兼性厌氧，利用葡萄糖产酸不产气。

二、原理：蛋白胨提供氮源;葡萄糖是可发酵的糖类;溴甲酚紫为pH指示剂。

三、配方(每升)：蛋白胨10g；葡萄糖5g；溴甲酚紫0.012g；最终pH7.1±0.2。

四、使用方法：

1、称取溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基15g,加入蒸馏水或去离子水1000毫升,搅拌加热煮沸至完全溶解,分装试管,115高压灭菌30min,混匀备用。

2、将已灭菌的嗜热脂肪杆菌芽孢菌片投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中,56±1培养48小时。

3、观察结果。

五、应用

用于牛奶中抗生素生物抑制法快速检测试剂盒的研发研究：

基于微生物抑制法原理,开发研制了牛奶中抗生素快速检测试剂盒。主要完成指示菌种的筛选与诱变、芽孢液体发酵条件的优化,芽孢萌发条件和试剂盒参数的优化,试剂盒适用性、灵敏度和稳定性的验证,以及试剂盒的应用评价。

结果如下：

1、对嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）进行诱变筛选,确定了嗜热脂肪芽孢杆菌最佳紫外辐射诱变的最佳条件为:诱变时间150 s;距离30 cm。通过抗生素药敏实验,筛选出一株菌,并命名为嗜热脂肪芽孢杆菌HY（B.stearothermophilus HY）。

2、对芽孢液体发酵条件进行优化,确定了嗜热脂肪芽孢杆菌HY产孢培养基最佳配比:蛋白胨0.8%;酵母粉0.3%;NaCl 0.3%;Mn2+0.9 mmol/L;Ca2+10 mmol/L;最佳发酵条件为pH7.0;接种量0.1%;装液量100 mL;培养时间24 h;温度65。对优化后的综合条件进行检测实验,结果液体发酵产孢率可达48%左右,较优化之前提高15%左右。

3、对芽孢萌发营养成分、条件和试剂盒参数进行优化,确定了芽孢萌发培养基最佳配比为蛋白胨1.0%;葡萄糖0.5%;琼脂0.5%;CMC 0.2%。芽孢萌发最佳条件,溴甲酚紫40 mg/L;pH7.0。以及试剂盒生产所需芽孢最佳包埋量为1×l0~7 CFU/mL,培养基最佳装入量为130μL/孔。

4、对试剂盒的检出限进行测定。对20多种抗生素的检出限测定结果如下:四环素100μg/L;土霉素100μg/L;金霉素100μg/L;多稀环素100μg/L;磺胺嘧啶100μg/L;磺胺二甲嘧啶50-100μg/L;磺胺间二甲嘧啶50-100μg/L;磺胺甲噁唑50μg/L;磺胺噻唑50-100μg/L;磺胺多辛（磺胺邻二甲氧嘧啶）100-200μg/L;磺胺喹恶啉50-100μg/L;青霉素1-2μg/L;阿莫西林2-4μg/L;氨卞西林2-4μg/L;头孢氨苄50-100μg/L;苯唑西林5-10μg/L;头孢喹肟25-100μg/L;头孢唑啉5-10μg/L;头孢噻呋100μg/L;庆大霉素200μg/L;卡那霉素1000-2000μg/L;新霉素500-1500μg/L;红霉素>40μg/L;泰乐菌素50-100μg/L;替米考星75-100μg/L;螺旋霉素150-200μg/L;林可霉素100-150μg/L;氯霉素2000-2500μg/L。