KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系的应用及培养操作！

一、背景

KLE人子宫内膜癌贴壁细胞是源自一名64岁白人女性的子宫内膜肿瘤组织，由G·R·Richardson于1984年建系。KLE细胞染色体为非整倍体，数目范围在51-66之间。KLE细胞裸鼠植瘤后，其肿瘤标本在电镜下显示，细胞间见紧密相连，细胞表面具有微绒毛。KLE细胞形态特征与孕激素刺激后的子宫内膜相似。

二、KLE人子宫内膜癌贴壁细胞培养步骤

1、KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM/F-12（推荐Bios-0005）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系细胞的复苏：：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10S的培养基来终止消化。

3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）KLE人子宫内膜癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。

三、应用

KLE人子宫内膜癌贴壁细胞可以用于分子靶向药物吉非替尼对子宫内膜癌细胞的作用：

选用子宫内膜癌细胞Ishikawa为研究对象，在体外实验中研究吉非替尼诱导Ishikawa细胞凋亡的作用及其下游可能的信号通路，初步探讨其作用机制，为子宫内膜癌的靶向治疗提供新的思路。

方法：

1、细胞培育：人子宫内膜癌细胞株Ishikawa，以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养，另加浓度为100U/ml的青霉素及链霉素的双抗，培养于37、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞呈单层贴壁生长，选用对数生长期进行实验。

2、应用MTT比色法检测不同浓度的吉非替尼对Ishikawa细胞生长的影响程度，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，绘制细胞的生长抑制率曲线。

3、应用流式细胞仪(flowcytometry,FCM)检测不同浓度吉非替尼作用前后对Ishikawa细胞周期变化及细胞凋亡率的影响情况。

4、应用Western-Blot方法检测不同浓度吉非替尼对Ishikawa细胞p-Akt、CyclinD1蛋白水平表达的影响。

结果：

1、吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa增殖的影响：不同浓度的吉非替尼(5uM,10uM,20uM,40uM)作用Ishikawa细胞24小时后抑制率分别为5.11±0.44%、10.58±0.07%、18.19±0.63%、33.03±0.46%；作用48小时后抑制率分别为7.52±0.71%、16.52±0.25%、30.42±0.55%、45.09±0.47%；作用72小时后抑制率分别为15.38±0.59%、27.78±0.22%、42.61±0.40%、57.03±0.44%。数据表明吉非替尼明显抑制Ishikawa细胞的增殖，分别随着吉非替尼浓度的增大和作用时间的延长，抑制率逐渐增加，呈时间-剂量依赖关系(P<0.05)。

2、吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa形态的影响：对照组的Ishikawa细胞形态规则，呈细长多边形，排列紧密，贴壁良好，呈对数生长。不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用Ishikawa细胞48h后，细胞出现皱缩变形，形态轮廓不清晰，细胞贴壁能力下降，脱壁悬浮。部分细胞崩解坏死。部分细胞出胞浆内出现空泡，呈现出细胞核浓缩、核碎裂等凋亡特征。贴壁细胞的密度明显少于对照组，凋亡细胞的数目多于对照组。

3、吉非替尼对Ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响：不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用于Ishikawa细胞48小时后，细胞凋亡情况如下：对照组为0.45±0.18%，实验组分别为2.47±0.64%、7.42±1.38%、14.05±3.00%、18.20±1.82%。随着吉非替尼浓度的增加，Ishikawa细胞的凋亡率逐渐增加，不同浓度组间差异明显，具有统计学意义(P<0.05)。不同浓度的吉非替尼作用于Ishikawa细胞48小时后，G0/G+1期细胞比例随着药物浓度的增大而升高，与对照组相比，不同浓度组间差异明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明细胞周期停滞于G0/G1期。而对S期，G2//M期细胞比例无明显影响，与对照组相比，不同浓度组间差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。

4、吉非替尼引起细胞周期阻滞的内在机制：应用Western blot方法检测不同浓度吉非替尼作用Ishikawa细胞48h后p-Akt、CyclinD1蛋白水平变化，结果显示：p-Akt、CyclinD1蛋白在Ishikawa细胞中均有表达。经过不同浓度(5uM,10uM,20uM,40uM)的吉非替尼作用后，Ishikawa细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白浓度随着吉非替尼浓度的增加而逐渐下降，并呈剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。