大鼠垂体瘤细胞的背景与应用及相关研究！

 

一、背景

 

大鼠垂体瘤细胞是由Tashjian AH等在1965年7月从一只7月龄的雌性Wistar-Furth大鼠的垂体肿瘤中分离建立的。GH3细胞系不是直接来源于GH1细胞系的克隆，而是从原代培养的GH1细胞在大鼠身上传代两次形成的肿瘤中建立的。上皮样的GH3细胞比GH1分泌更高水平的生长激素，也可产生催乳素。对调控GH3细胞分泌蛋白类激素的研究表明，氢化可的松可以刺激生长激素的分泌、抑制催乳素的产生。

 

二、大鼠垂体瘤细胞培养步骤

 

1、大鼠垂体瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

 

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

 

2）大鼠垂体瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

 

3）大鼠垂体瘤细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

 

2、大鼠垂体瘤细胞细胞处理：

 

1）复苏大鼠垂体瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

 

2）大鼠垂体瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

 

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

 

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

 

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

 

3）大鼠垂体瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

 

三、应用

 

大鼠垂体瘤细胞可以用于LncRNA MEG3对垂体瘤细胞增殖，凋亡及EMT影响及其分子机制：

 

探讨lncRNA MEG3在垂体瘤中的作用及其机制。

 

第一部分LncRNA MEG3在垂体瘤组织中的表达目的:检测lncRNA MEG3在垂体瘤患者中的表达。

 

方法：

 

1、GSE77517从GEO数据库下载。

 

2、搜集垂体瘤患者肿瘤组织样本和正常癌旁组织样本34对,qRT-PCR检测lncRNA MEG3表达。

 

3、qRT-PCR检测不同分期垂体瘤肿瘤组织中MEG3的表达。

 

4、Pearson’sχ2分析MEG3的表达与垂体瘤患者临床特征的关系。

 

结果：

 

1、相较于正常组织,lncRNA MEG3在垂体瘤肿瘤组织中表达量显著降低。

 

2、LncRNA MEG3在-期垂体瘤患者组织中的表达显著低于-期垂体瘤患者。

 

3、LncRNA MEG3的表达与垂体瘤的侵袭性和临床等级显著相关。

 

结论：LncRNA MEG3在垂体瘤患者组织中低表达并与垂体瘤的侵袭性和临床等级显著相关。

 

第二部分LncRNA MEG3对大鼠垂体瘤细胞活性的影响目的:探讨LncRNA MEG3对大鼠垂体瘤细胞活性。

 

方法：

 

1、设计MEG3过表达序列,在大鼠PA细胞MMQ和GH3中上调MEG3的表达。

 

2、细胞增殖通过CCK-8法检测。

 

3、流式细胞仪和蛋白质印迹法检测PA细胞凋亡。

 

4、细胞迁移和侵袭均通过Transwell法检测。

 

5、蛋白质印迹法检测EMT相关因子(E-cadherin,Twist,Slug,MMP-7)的相对蛋白表达量。

 

结果：

 

1、MEG3表达的上调可以抑制PA细胞GH3和MMQ细胞增殖能力。

 

2、MEG3表达的上调可以促进垂体瘤细胞GH3和MMQ细胞凋亡。

 

3、MEG3表达的上调可以抑制垂体瘤细胞GH3和MMQ的细胞增殖,细胞迁移和侵袭能力。

 

4、MEG3表达的上调可以增加垂体瘤细胞GH3和MMQ中E-cadherin的表达,并抑制Twist,Slug和MMP-7的表达。

 

结论：LncRNA MEG3的上调可以促进大鼠垂体瘤细胞凋亡并抑制其增殖,迁移,侵袭和EMT。

 

第三部分 LncRNAMEG3靶向miR-23b-3p/FOXO4目的:探讨lncRNAMEG3调控垂体瘤的分子机制。

 

方法：

 

1、在线生物学工具预测MEG3靶向的miRNA。

 

2、荧光素酶报告实验检测预测结果。

 

3、RNA pull down实验检测预测结果。

 

4、qRT-PCR检测该miRNA在转染了MEG3/NC后的GH3和MMQ细胞中的表达。

 

5、qRT-PCR检测该miRNA在垂体瘤组织样本中的表达。

 

6、Spearman’s相关分析计算垂体瘤组织中miRNA的表达和MEG3表达的相关性。

 

7、在线生物学工具预测miRNA下游的mRNA。

 

8、荧光素酶报告实验验证该预测。

 

9、RNA pull down实验检测预测结果。

 

10、蛋白质印迹法和qRT-PCR均被用来转染后的PA细胞中该基因的表达。

 

11、qRT-PCR检测垂体瘤肿瘤组织中该mRNA的表达。

 

12、Spearman’s相关分析计算MEG3/miR-23b-3p和预测的mRNA表达的相关性。

 

结果：

 

1、LncRNA MEG3靶向miR-23b-3p。

 

2、在垂体瘤细胞GH3和MMQ中,上调MEG3的表达可以抑制miR-23b-3p的表达。

 

3、miR-23b-3p在正常组织中的表达显著低于其在垂体瘤组织中的表达。