小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14的传代方法及应用！

一、背景

MC3T3-E1 SUBCLONE 14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14是从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆。从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。MC3T3亚克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亚克隆14（ATCC CRL-2594）在抗坏血酸和3到4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化。它们10天后形成一个矿化良好的细胞外基质（ECM）。

MC3T3亚克隆24（ATCC CRL-2595）和MC3T3亚克隆30（ATCC CRL-2596）在抗坏血酸中生长表现出很差的成骨细胞分化。不形成ECM，可以作为亚克隆4和14的阴性对照。矿化的亚克隆选择的表达作为成骨细胞标记的mRNA，及唾液酸糖蛋白（BSP），骨钙素（OCN），和甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体的mRNA。

二、传代方法

1、尽量吸干净T25瓶原培养基；

2、加3-4ml常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；

3、T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层；

4、将培养瓶放入37度培养箱消化；

5、消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消化；

6、混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；

7、加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里；

8、补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养；

三、应用

用于维生素B2与牵张力对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响及机制初步研究：

对维生素B2与牵张力对小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）成骨分化的影响及机制进行初步探索。

方法：在不同浓度的维生素B2（0μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L）作用下培养MC3T3-E1细胞（记为维生素B2组）,在不同力值（0%、5%、10%、15%,）0.5 Hz牵张应力作用下培养MC3T3-E1细胞4h,连续7天（记为加力组）,上述培养基均为含有成骨诱导液（50 mg/mL抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠）的α-MEM完全培养基。

分别用CCK-8/MTT法检测细胞在不同维生素B2浓度和牵张力值作用下的增殖变化,用划痕实验检测加力组细胞的迁移能力,用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测细胞ALP活性的变化,用茜素红染色观察矿化结节形成,用Western blot（WB）检测Runx2、OPN、p38、β-catenin等蛋白的表达情况。

根据维生素B2组与加力组的检测结果确定适宜维生素B2浓度aμmol/L及适宜力值b%,然后以对照组、aμmnol/L、b%、aμmol/L+b%分组,用Westem blot（WB）检测Runx2、OPN、β-catenin及相关信号通路上下游蛋白的表达情况,来检测维生素B2与牵张力共同作用下对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响及可能的机制。结果维生素B2组中,CCK-8检测显示维生素B2浓度为0-1μmol/L时OD值明显升高（P<0.01）,而浓度为1-25μmol/时OD值有所下降,但差异不具有统计学意义（P>0.05）。

维生素B2浓度为1μmol/L时,碱性磷酸酶活性和矿化结节生成量都有显著提高,并且促进了Runx2、OPN、β-catenin的表达,但对p38的表达无显著影响（P>0.05）。在加力组中,MTT检测OD值显示在牵张力作用下细胞增殖能力增强,在拉升应变率为10%时达到最大,并且牵张力能显著提升细胞迁移能力。Western blot结果显示10%力值能显著促进Runx2、OPN、p38、β-catenin的表达（P<0.05）,并且力值达到15%时促进作用减弱。因此选用维生素B2浓度为1μmol/L,牵张力值为10%进行第三部分实验。

结果证实了两者对促进成骨具有协同作用,并且与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。结论适宜浓度的维生素B2和适宜力值的牵张力都能分别促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化,并且两者间具有一定的协同作用,而wnt/β-catenin信号通路可能参了与该过程的调控。