胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B的背景与特性及其应用！

一、背景

胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B是把高纯度的胰蛋白酶固定到活化好的琼脂糖凝胶上，它可以用于酶切，同时也可以纯化一些能和它结合的物质，如丝氨酸蛋白酶抑制剂等。

二、胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和填料特性

特点基团脱落少，结合特异性强

配基胰蛋白酶

配基密度≤10mg/mL

亲和填料的颗粒大小45-165μm

最大流速300cm/h

pH范围1.5-10，在位清洗时pH范围可到1.5-10

使用温度4~常温

保存温度+4~8

保存液体20%乙醇

适用范围胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B用于纯化各种与之结合的物质，如酶抑制剂等。

三、胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和填料应用的注意事项

（1）凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产生气泡影响柱效。

（2）吸附：20-50mM,pH7.4-8.0含0.2-0.5M NaCL的缓冲液，zui常用的为Tris-HCl缓冲液。

（3）洗脱：可以用浓度为0.2-2M的pH1.5-5左右的酸性缓冲液进行阶段或者线性洗脱。

（4）上样样品必须与平衡柱子的缓冲液的pH、电导相同。

（5）不同的样品，吸附和洗脱方法不相同，可以根据相关的文献进行。

（6）胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和填料的再生处理方法：先用0.1M Tris-HClpH7.0缓冲液洗3个柱床体积，然后用0.1M NaOH含2MNaCl流洗3个床体积,zui后用3M NaCL洗3个床体积即可。如果再生的效果还不好，也可以用0.2-0.5M pH1.5的缓冲液冲洗3-5个柱床体积，然后再用水清洗，保存在20%乙醇中即可。长期不用zuihao加抑菌剂如0.2%叠氮钠,酸洗柱子的时间不能太长，否则会缩短填料的寿命。

（7）该亲和填料保存条件为20%乙醇，+4~8。

四、应用

胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B可以用于Kunitz型和Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化及鉴定：

以大豆种子为原料，探索既高效、便捷又效果好的KTI和BBI分离纯化方法，为今后对二者的进一步深入研究奠定理论基础。以大豆为原料，经过粗提液的制备和层析等方法研究一种纯化效率较高的Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，并与一步法进行比较分析。

选用吉育52大豆为原料，经研磨、脱脂、酸抽提、热变性、35%-75%(NH4)2SO4分步沉淀等制备KTI粗提液，再采用离子交换、亲和层析、葡聚糖凝胶等多步法和亲和层析一步法分别进行KTI的纯化并进行SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。

结果表明，10g大豆通过多步法纯化得到纯化倍数为72.39倍的KTI，而通过一步法纯化得到的纯化倍数为28.85倍。这两种方法经SDS-PAGE电泳检测均得到单一条带，其近似分子量为19.4kD。

对多步法分离纯化得到的KTI作进一步的纯度分析，经MALDI-TOF检测可知，KTI的精确分子量为22907.51Da；N-端氨基酸测序结果显示，该KTI与多种Kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。对上述结果进行比较分析，发现多步法的纯化倍数要远高于一步法，表明多步法要优于一步法；而且纯化得到的KTI与多种Kunitz家族胰蛋白酶抑制因子有较高的同源性。

以大豆种子为原材料，经过粉碎、正己烷脱脂、50%乙醇抽提、65热变性、等电点沉淀和丙酮沉淀得到BBI粗提物。粗提液先后经过DEAE-52离子交换层析和胰蛋白酶-琼脂糖凝胶4B亲和层析得到BBI纯品，之后，进行尿素SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF检测及N-端氨基酸测序以鉴定其纯度。

结果表明，经过粗提液制备、离子交换层析和亲和层析后，BBI的比活力为882.31U·mg-1，比原来粗品17.62U·mg-1的比活力大约提高了50倍，活性回收达到了69.34%。

SDS-PAGE电泳结果显示BBI的近似分子量为9.8kD，经MALDI-TOF检测BBI的精确分子量为8837.46Da，N-端氨基酸测序结果显示，BBI与多种Bowman-Birk家族胰蛋白酶抑制因子具有较高的同源性，其中，与Glycine max、Glycinesoja、Vigna marina、Phaseolus grayanus及mung bean的同源性分别为80%、80%、73%、72%和60%，说明纯化效果理想。