硫氧化硫杆菌的实验材料和方法及结果与总结！

一、菌种简介

氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans,T.t)于1922年由Waksman和Joffe分离得到，具有快速氧化单质硫以及还原态的硫化物的功能。专性好氧,嗜酸,革兰氏阴性菌,棒状,大小为1×2mm,宽0.3~0.5μm，长1.0~2.0μm。氧化硫杆菌以氧化单质硫或还原态的硫化物来获得自身细胞生长和代谢所需要的能量,以NH4+为氮源,以空气中CO2为碳源。

二、产品信息

平台编号：Bio-134513

规格：冻干物

拉丁属名：Thiobacillus Thiooxidans

中文名称：硫氧化硫杆菌

拉丁名称：Thiobacillus thiooxidans

模式菌株：否

来源历史：←

收藏时间：2021/8/4

原始编号：BJMCC1.101

参考用途：生物浸矿。

生物危害程度：四类

致病对象：无

培养基名称：Sulfobacillus Medium

培养基成分：溶液A：(NH4)2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，蒸馏水700mL，用硫酸调节pH2.0-2.2。高压蒸汽灭菌。 溶液B： FeSO4•7H2O 44.2g，蒸馏水300mL，10N H2SO4 1mL。过滤除菌。 溶液C：酵母浸粉（1% w/v水溶液） 20mL，高压蒸汽灭菌。 上述分别灭菌后三个溶液混合即可，pH1.9-2.4。 [注] 若需要配制固体平板，琼脂粉溶液（终浓度15g/L）需要单独高压蒸汽灭菌后，与上述成分冷至55时，混合倾注平板。

培养温度：30

需氧类型：好氧

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

三、材料和方法

1、水样采集

水样取自某矿矿坑。取样方法如下:先将用牛皮纸扎好的取样瓶与取样勺用高压灭菌器高压灭菌,在取样点打开牛皮纸,用酒精灯烧灼瓶口,舀取水样至取样瓶三分之二处,迅速扎好牛皮纸带回。

2、培养基的配制

液体培养基采用Starky - Na2 S2O3 培养基和Waksman 培养基。 固体培养基采用Starky -Na2 S2O3 - 琼脂培养基。

3、水样处理

考虑到水样的pH值在2. 5 左右,适合氧化硫硫杆菌的生长,细菌数目较多,所以将水样倍比稀释1 000倍。

4、细菌分离

取稀释后的水样10 mL加入到90 mL Starky- Na2 S2O3 培养基中,置恒温水浴摇床培养,温度设定为30,转速设定为200 r /min。待菌液pH值达到1. 0左右时,取5 mL菌液加入到95 mL新的培养基中。如此反复进行5次。

5、细菌纯化

在事先用紫外线灭菌的洁净操作工作台中,取10μL培养好的菌液加入到固体培养基上,再用灭菌的涂菌器将菌液涂布均匀。将培养皿正置室温2 h后转到30恒温培养箱中倒置培养。

6、单克隆挑选与培养

用灭菌的10 μL tip 头从培养皿表面挑取形态规则,大小适中的单个菌落转到液体培养基中,置30水浴摇床中培养。转速设置为200 r /min。待菌液pH值达到1. 0左右时,取5 mL菌液加入到95 mL 新的培养基中(同时接种到Starky -Na2 S2O3 培养基和Waksman培养基中)。如此反复进行5次。最后一次培养时,每天测定pH值,当pH值达到1. 0左右时用血球计数板计数细菌量。

四、实验结果

1、细菌分离

培养时每天测定pH值,到第7天时pH值达到了1. 0. 染色后镜检发现视野下有较多行动活跃的杆菌。

2、细菌纯化

培养进行到第12天可以看到培养皿上有针尖大小的菌落,到第20天可以看到菌落直径长至1 mm左右,呈绿色。

3、克隆挑选

挑选单克隆转到液体培养基中培养,每天测pH值,其中pH值变化最快的一株菌株变化情况使用血球计数板计数,氧化硫硫杆菌的数量都达到了每毫升107 个。

五、总结

关于能在矿坑水和矿体土壤中生存的细菌已有不少的报道。目前用人工合成培养基已经分离培养了许多新菌种,这些新菌种被推广和应用到生产过程中,产生了巨大的经济效益和社会效益。

用于矿物浸出的微生物多为化能自养菌,在繁殖和生长过程中,不要求任何有机物,纯粹靠无机物为能量来源。 对于某些细菌,比如氧化亚铁硫杆菌,一些有机物的存在还会抑制其生长。 这些浸矿细菌有着一些共同的特点:它们能在普通微生物所不能生存的强酸性矿坑水中生存,革兰氏染色为阴性,活动能力较强,通过直接作用和间接作用浸出矿石。

氧化硫硫杆菌作为浸矿细菌的一种,生长过程中也不需要有机物,它能通过对硫及其化合物的氧化获得生长和繁殖必须的能量。同时,在这个过程中会产生硫酸和能溶于酸性介质的金属元素,达到加快浸矿速度,减少酸耗,从而降低生产成本的作用。并且,它在对贫矿和尾矿的处理上有其独特的优势。 所以,选育生长能力强,氧化性能好的氧化硫硫杆菌具有重要的意义。

本研究中我们使用了Starky - Na2 S2O3 培养基和Waksman培养基,研究发现,氧化硫硫杆菌在使用Na2 S2O3 做能源时, pH值呈现先升高后降低的趋势,我们认为这是因为在氧化硫硫杆菌生长的初期,它在溶液中发生缓慢的歧化反应,生成亚硫酸钠和硫单质,这两者都是氧化硫硫杆菌极易利用的还原性物质。同时,硫代硫酸钠和亚硫酸钠的水解释放出OH- ,使溶液的pH缓慢上升。在经过7天的迟缓期,随着氧化硫硫杆菌进入对数生长期,才开始发挥其对硫和还原性含硫化合物的卓著的氧化作用能力而开始产生大量硫酸,使pH值大幅下降。此过程可以用以下反应式表示:2S + 3O2 + 2H2O→2H2 SO4

而使用硫做底物时, pH值先是缓慢下降7天左右,然后开始迅速下降. 我们认为主要是培养初期细菌数量较少,当生长7天后,细菌进入对数生长期,细菌数量迅速增加,产生的硫酸相应增多,引起pH值迅速降低. 所以这两种培养基都可以用于氧化硫硫杆菌的培养,但是如果使用氧化硫硫杆菌浸矿时,由于它在Waksman培养基中生长时,没有pH值上升的过程, pH值下降更迅速,更有利于浸矿反应。