小鼠树突状细胞的背景与应用及培养步骤！

一、背景

小鼠树突状细胞是一类梭形,胞突呈分枝状，常有大小粗细不等的胞突的贴壁细胞。DCS小鼠树突状细胞肉瘤是L瘤株在615小鼠皮下移植后，取脾脏原代培养，传20代后形成的癌变细胞：细胞呈多角形、梭形及不规则形，胞突呈分枝状，常有大小粗细不等的胞突；经鉴定证明是小鼠树突状肉瘤细胞；在615小鼠皮下移植后成瘤。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于鼠李糖乳杆菌对猪轮状病毒感染BALB/c小鼠树突状细胞分化与发育的影响研究：

将108只3-4周龄的BALB/c小鼠随机分为三组,分别为:LGG+PRV组、PBS+PRV组和PBS对照组:LGG+PRV组攻毒前7天每隔一天口服鼠李糖乳杆菌一次,浓度为100μL（106cfu）/只,第八天口服猪轮状病毒,浓度为200μL/只;PBS+PRV组攻毒前七天口服同计量的磷酸盐缓冲液（PBS）,第八天口服猪轮状病毒,浓度为200μL/只;PBS组免疫攻毒期都口服PBS。

观察小鼠体重变化状况,于24h,48h,72h,96h不同时间点进行如下指标的检测：（1）流式细胞术（FCM）检测小鼠MLN、脾脏中CD11c+CD11b-CD8α+、CD11c+CD11b+CD8α-、CD11c+B220+CD8α+、CD11c+B220+CD8α-DC亚群分化情况和MHC-,CD80、CD86、CD40共刺激因子的表达水平；

（2）QRT-PCR检测小鼠MLN与小肠中TLR3、NF-kappaB、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12以及IFN-γ的mRNA水平；

（3）ELISA法检测IL-10和IFN-γ的含量变化。

结果表明：（1）PRV感染后LGG+PRV组与PBS+PRV组DCs亚群分化不同,LGG+PRV组主要向CD11c+CD11b-CD8α+、CD11c+B220+CD8α+DC亚群分化（P<0.05）,PBS+PRV组主要向CD11c+CD11b+CD8α-、CD11c+B220+CD8α-DC亚群分化（P<0.05）。说明鼠李糖乳杆菌免疫后促进机体CD8α+DCs的分化,进而高效的提呈抗原,并活化初始T淋巴细胞的免疫应答,激活适应性免疫。并且LGG+PRV组DCs高表达MHC-和CD80、CD86、CD40,由其48h时MHC-+DCs的极显著表达（P<0.01）说明LGG免疫后促进淋巴器官中DCs成熟,诱导T细胞进行免疫识别促进T细胞免疫反应,激活适应性免疫。

（2）QRT-PCR检测结果显示LGG+PRV组增加TLR3、NF-κB、IL-12、IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γmRNA的表达,48h-72h时TLR3、NF-κB、IL-12、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达水平差异显著（P<0.05）。PBS+PRV组也呈增加趋势,其中IL-10、IL-6表达量显著（P<0.05）,但IFN-γ的mRNA表达水平呈降低趋势。说明LGG免疫后感染病毒时促进机体分泌TLR3、NF-κB和其他细胞因子,尤其是炎性细胞因子,从而激活TLR3与NF-κB通路增强机体固有免疫反应,介导适应性免疫发生白细胞混合反应,并发生Th1/Th2偏振反应,避免对机体的不利损伤。

（3）ELISA检测IL-10、IFN-γ的表达水平进一步说明LGG抗PRV感染时主要调节Th1型及炎性细胞因子的分泌,促进免疫应答以抑制和缓解病毒感染。以上研究结果表明LGG促进DCs分化与成熟,同时分泌TLR3、NF-κB及多种细胞因子,促进固有免疫和适应性免疫两方面的免疫应答,从而抑制和缓解病毒感染。