SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的应用及操作步骤！

一、背景

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒把SDS-PAGE凝胶配制所需的Tris-HCl、Acr-Bis（29:1）、SDS等预混合成上、下层胶预混液，使用前仅需加入适量促凝成分和TEMED即可在1 h内完成下层胶（分离胶）和上层胶（浓缩胶）的配制。其中上层浓缩胶带有淡红色，点样孔清晰易辨，便于上样。极大程度上简化了凝胶制备的操作流程，降低了实验人员接触剧毒试剂的机率，具有快速、方便、安全、稳定等特点。

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒约可配制50块（mini型1 mm）大小的12%SDS-PAGE凝胶（蛋白样品的最佳分离范围为12-60 kD）。具体可以配制的凝胶数量和凝胶的厚薄、大小以及操作手法有关。

二、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒操作步骤

根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度。

（一）灌制分离胶

1、参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。

2、将不同体积的30r-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer、SDS Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。

3、加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

4、在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

5、静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表面凝胶已聚合。

（二）灌制浓缩胶

1、去除覆盖在分离胶上的水层。

2、将不同体积的30r-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer、SDS Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。

3、加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

4、将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

5、将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

6、静置10~20分钟，等待浓缩胶聚合。

7、待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。

8、进行常规电泳操作。

三、应用

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒可以用于手足口病毒鸡卵黄抗体的制备及抗病毒作用研究：

通过制备抗肠道病毒71型鸡卵黄抗体(anti-EV71 IgY),开展其在体内及体外抗肠道病毒71型(EV71),体外抗柯萨奇病毒A16型(CVA16)的相关检测,并对其抗EV71和CVA16的作用机制进行探讨。以期探索出一种新的能交叉被动免疫治疗由EV71和CVA16引发的手足口病(HFMD)方案。

方法：以EV71毒株作为抗原,与弗氏不完全佐剂1:1混合并吹打使其乳化均匀,通过多次注射来免疫SPF级母鸡,收集并提取纯化IgY;蛋白定量法检测IgY的总蛋白浓度;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试IgY纯度;采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)来评价特异性IgY的浓度变化规律;蛋白质印记法和免疫双向琼脂扩散法检测纯化IgY的特异性;采用观测人横纹肌肉瘤细胞(RD)的细胞病变效应(CPE)检测特异性IgY体外对EV71与CVA16中和能力的量效关系,抗EV71稳定性和时效性;通过免疫荧光法检测特异性IgY在非洲绿猴肾细胞(Vero)中的抗EV71作用;灌胃给药检测特异性IgY对被EV71病毒感染的新生BALB/c鼠的保护作用。

结果：IgY总蛋白浓度在免疫后整体呈上升趋势;SDS-PAGE电泳图显示纯化的IgY纯度良好,可被分裂为分子量约为70 kDa的IgY重链(H)及30 kDa的IgY轻链(L);通过ELISA我们发现特异性IgY浓度在免疫后的第7天出现增加,在第7周达到最高,并在较高水平维持4周左右;免疫双向琼脂扩散实验与Western blot测得特异性IgY具有与EV71、CVA16毒株良好的免疫结合性,能特异性识别EV71和CVA16的包膜蛋白VP1及VP3;IgY体外中和病毒实验结果显示,特异性IgY能抑制EV71病毒和CVA16病毒的感染病变能力,并呈剂量-效应相关关系,差异具有统计学意义;特异性IgY在感染早期对EV71病毒有很强的抑制作用,感染后期抑制效果不明显;特异性IgY在4、室温、37条件下48 h后抗病毒活性依然稳定,60条件下1.6μg/mL仍能对病毒达到100%的抑制率。反复冻融5次后对IgY的抗病毒活性没有影响。

特异性IgY对肠道病毒EV71、CVA16有很强的抑制活性,对其他肠道病毒抑制效果不明显;免疫荧光法显示特异性IgY在3.72μg/mL对Vero细胞中的毒株能达到近乎100%的抑制作用;特异性IgY实验组新生鼠生存率达到100%,相比于对照组无消瘦,精神萎靡,毛发生长异常等症状。

结论：(1)免疫后提取的特异性IgY纯度与抗病毒特异性良好。

(2)特异性IgY能识别EV71、CVA16病毒的包膜蛋白VP1与VP3,在体外抗病毒实验中能有效地抑制EV71病毒和CVA16病毒活性并呈剂量-效应相关关系。

(3)特异性IgY作用于EV71感染早期处理明显优于后期,并且特异性IgY的稳定性较好。

(4)特异性IgY灌胃给药后可以对被EV71攻击的乳鼠提供保护。