人胚胎膀胱组织来源细胞的知识与应用及培养操作！

一、背景

人胚胎膀胱组织来源细胞是分离自胚胎膀胱组织的原代细胞，主要用于胚胎膀胱组织细胞的相关细胞学研究。

二、培养操作

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类;

1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人胚胎膀胱组织来源细胞可以用于干细胞关键转录因子Oct4在人膀胱移行细胞癌中的表达及对人膀胱癌EJ细胞生物学的影响：

观察干细胞关键转录因子Oct4在膀胱移行细胞癌中的表达,并探讨Oct4基因沉默对人膀胱癌EJ细胞生物学的影响,探讨Oct4基因作为膀胱癌基因治疗靶点的可行性和有效性。

方法：分别用免疫组化和实时定量RT-PCR检测74例膀胱癌组织和32例癌旁组织及24例正常膀胱组织病理标本中的Oct4表达;并将人膀胱癌EJ细胞,常规分为空白对照组、阴性对照组和实验转染组进行实验。体外化学合成Oct4基因序列特异性小干扰RNA(siRNA),脂质体Lipofectamine 2000介导转染人膀胱癌细胞株EJ细胞;采用RT-PCR和Western印迹方法分别检测特异性siRNA对Oct4基因在mRNA和蛋白水平上沉默效果;转染后采用MTT法检测siRNA对细胞增殖的作用;AO/EB荧光染色法检测其凋亡情况;用细胞划痕和Transwell试验体外检测细胞迁移和侵袭能力。

结果：免疫组化显示Oct4在膀胱癌组织的表达明显高于癌旁组织和正常膀胱组织,阳性表达率分别为83.78%、21.87%、0%,各组差异有统计学意义(P<0.05),Oct4在膀胱癌不同病理分级中的阳性表达率分别为G1组66.67%、G2组87.50%、G3组100%,在淋巴结转移组和非淋巴结转移组的阳性表达率为92.3%,79.1%,随着病理分级的升高和淋巴结转移的出现,Oct4表达水平逐渐升高,各组间差异有统计学意义(P<0.05),但不同分期的膀胱癌组织中Oct4表达差异无统计学意义(P>0.05);实时定量RT-PCR结果显示Oct4在膀胱癌组织中的表达是癌旁组织的的2.0倍,是正常膀胱组织的3.41倍,各组差异有统计学意义(P<0.05),但不同分期的膀胱癌组织中Oct4表达差异无统计学意义(P>0.05);成功转染Oct4-siRNA的膀胱癌EJ细胞,RT-PCR及Western blot分别显示Oct4mRNA和蛋白表达在相应的癌细胞中明显下降;与阴性对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时细胞凋亡率增加(52.73%比11.7%);RNA干扰组明显抑制EJ细胞迁移力和侵袭力(15.34±1.85比63.07±1.73)。

结论：Oct4的表达与膀胱癌的分级和淋巴结转移密切相关但与临床分期无关,Oct4的过高表达可能在膀胱癌的发生发展中起重要作用;Oct4-siRNA可以有效地抑制膀胱癌EJ细胞Oct4基因的表达,从而抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,Oct4-siRNA有效的调控EJ细胞恶性生物学行为。