人十二指肠腺癌细胞的传代与应用及操作方法！

一、背景

人十二指肠腺癌细胞是分离自人十二指肠腺癌组织的上皮细胞样贴壁细胞系，主要用于人十二指肠腺癌的体外研究。

十二指肠腺癌指起源于十二指肠黏膜上皮的癌。多为单发，可由腺瘤恶变而来。组织学上可见腺瘤-腺癌转化及腺癌中的残存腺瘤组织。十二指肠腺癌多发生于降部乳头周围，约占60%，其次为壶腹下段，球部最少见。

二、操作方法

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

三、细胞传代

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，最后放入37，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

四、应用

用于蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞凋亡的比较蛋白质组学研究：

通过比较蛋白质组学的研究手段,用蓖麻毒蛋白诱导人十二指肠腺癌细胞（HuTu-80）,分析全蛋白差异表达的情况,为蓖麻毒蛋白在HuTu-80细胞中的作用机理提供新的试验窗口。

1、首先采用硫酸铵盐析法,从蓖麻种籽中提粗素,通过Sepharose4B柱亲和层析和Sephacryl S-200柱凝胶过滤层析对其进行纯化,经p-巯基乙醇处理,可见A链分子量为28KDa,B链的分子量为32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鉴定纯化后的蓖麻毒素达到了电泳纯。测定其浓度后,用获得的蓖麻毒蛋白对HuTu-80细胞进行ICso试验。结果表明：细胞形态发生变化,而IC50为200ng/ml。

2、构建蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞的凋亡模型,通过MTT排除试验、AO/EB染色、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,确定蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞早期凋亡时相,提取细胞组分蛋白进行Western-blot分析,观察HuTu-80细胞在凋亡过程中细胞色素c的迁移情况。

结果表明：蓖麻毒蛋白对HuTu-80细胞的增殖和生长有明显的抑制作用,IC50为200ng/ml,最佳攻毒时间为8h,同时HuTu-80细胞的形态特征与生物化学特征也发生了一系列的变化,细胞核出现皱缩和破裂的情况,释放出致密颗粒状凋亡小体,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸出现外翻,而细胞色素c随着蓖麻毒蛋白处理时间的增加,从线粒体易位到细胞浆逐渐显著。