人乳腺导管癌细胞的培养操作步骤及应用研究！

一、背景

人乳腺导管癌细胞是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本MDA-MB-435细胞中筛选得到。MDA-MB-435细胞是从31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到。当用荧光染料对微管蛋白进行染色时，亲本细胞显现散布特征(型)。最近通过cDNA阵列研究表明，亲本(MDA-MB-435细胞)可归入黑素瘤起源。

二、人乳腺导管癌细胞培养操作

1）复苏人乳腺导管癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人乳腺导管癌细胞传代：如果人乳腺导管癌细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人乳腺导管癌细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人乳腺导管癌细胞冻存：待人乳腺导管癌细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、人乳腺导管癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人乳腺导管癌细胞可以用于B-降胆甾醇衍生物的合成及抗肿瘤活性研究：

参考胆固醇在人体中的生物降解程序,以胆固醇为原料,经过臭氧氧化、环化缩合、还原及氧化反应,分别得到6个B-环断环胆固醇和B-环缩环胆固醇(B-降胆固醇)及它们的还原产物及氧化产物,然后对这些胆固醇的降解产物分别进行体外抗肿瘤活性筛选研究。

在此研究的基础上,对B-降胆固醇的3-位羟基进行酯化修饰,形成不同结构的酯基,同时将6-位醛基氧化成为羧基或者还原成醇,最后合成得到一系列3-酯基-B-降胆甾-6-羧酸和3-酯基-B-降胆甾-6-醇。此部分工作共合成得到28个化合物,其中包括12个文献未见报道的中间产物和14个文献未见报道的目标产物,所有合成物都经过了IR、NMR和HRMS的结构表征。

同时,采用卵巢癌细胞(SKOV3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人乳腺导管癌细胞(T47D)、人肺癌细胞(H460)和人肾上皮细胞(HEK293T)作为筛选对象,对合成物进行了体外抑制肿瘤细胞生长增殖活性测试。

保留对B-降胆固醇3-位羟基的酯化修饰,但将B-降胆固醇的6-位醛基进一步转换成为在前期工作中证实具有显著抗肿瘤活性的缩氨硫脲药效团,由此得到一系列的3-酯基-B-降胆甾缩氨硫脲化合物。

另外,经过类似的合成方法,在获得B-降胆甾醇母体后,将3-位羟基氧化为羰基,然后6-位醛基转换成为4-甲基硫代缩氨基脲,3-位羰基进一步肟化或转换成为其它含N的肟醚官能团,合成得到5个具有不同3-取代官能团的B-降胆甾-4′-甲基硫代缩氨基脲衍生物。

本部分工作共合成得到25个化合物,其中包括8个文献未见报道的中间产物和12个文献未见报道的目标产物。所有合成物都经过了IR、NMR和HRMS的结构表征。同时,采用卵巢癌细胞(SKOV3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人乳腺导管癌细胞(T47D)和人肾上皮细胞(HEK293T)作为筛选对象,对合成物进行了体外抑制肿瘤细胞生长增殖活性测试。