KASUMI-1人红白血病传代细胞系的知识与应用！

一、背景

KASUMI-1人红白血病传代细胞系建立于一位急性白血病患者的外周血，KASUMI-1人红白血病传代细胞系髓过氧化物酶阳性，显示其髓性成熟的形态。增生试验显示，培养的KASUMI-1人红白血病传代细胞系对IL-3、IL-6、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CS(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)有响应，但对IL-1和IL-5没有响应。在体外液体培养中分别加入二甲亚砜、G-CSF、IL-5，也没有观察到粒性或嗜酸性细胞的成熟。KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养过程中，加入佛波酯可以看到诱导出的巨噬细胞样细胞。

KASUMI-1人红白血病传代细胞系具有人急性淋巴白血病细胞的典型特征，是研究人急性淋巴白血病的极佳材料。KASUMI-1人红白血病传代细胞系是一个带有8：21号染色体转位的白血病细胞株，这个转位使得AML1基因和ETO(或称MTG8)基因串联，使融合基因AML1-ETO(也称作AML1-MTG或RUNX1-CBF2T1)的表达升高，因而细胞产生嵌合的AML1-ETO蛋白。这个蛋白下调CEBPA mRNA、蛋白和DNA的结合活性，而这种结合对粒性白细胞的分化是极端重要的。

二、KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养步骤

1、KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，20%；Gluta-max（invitrogen 35050）1%；双抗，1%。

2）注意事项：

a)该细胞复苏后成活率较低，会出现大量死细胞和死细胞碎片，培养两周后有所好转。建议每1-2周对细胞进行1000rpm,5mins离心，弃掉上清，加入新鲜完全培养液，可以去掉部分细胞碎片和颗粒。培养过程中会出现死细胞和细胞碎片，收到邮寄的活细胞的用户若发现培养物内有部分死细胞和细胞碎片，此为正常现象。

b)细胞培养过程中会有轻微聚团，轻轻吹打开即可。当细胞密度较大或者培养液变黄时，需要及时进行半换液或者完全换液。

c)该细胞对血清质量较为敏感，我库建议您使用进口大品牌优质血清进行培养。

d)请注意保持细胞密度在合适的范围（3x105~3x106/ml），不能过稀。

3）KASUMI-1人红白血病传代细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

4）KASUMI-1人红白血病传代细胞系冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞处理：

1）复苏KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞：将含有1mLKASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于KASUMI-1人红白血病传代细胞系贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1、KASUMI-1人红白血病传代细胞系细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

KASUMI-1人红白血病传代细胞系可以用于地西他滨诱导Kasumi-1白血病细胞G2/M期阻滞和凋亡的作用机制研究：

为了明确原发性AML中甲基转移酶的表达和DNA甲基化情况,本研究首先利用TCGA癌症基因组图谱数据库及DNA甲基化修饰情况进行分析,结果发现DNMT3a在人AML中表达上调,DNA甲基化修饰增多。接下来,添加DAC培养原发性AML细胞系Kasumi-1,并检测其生物学行为,结果显示,DAC抑制Kasumi-1细胞增殖、影响细胞周期阻滞于G2/M期,促进细胞凋亡。

为了进一步验证DAC对细胞周期的调控作用,用RT-q PCR方法检测调控细胞周期调控因子的表达,结果发现p21、p53、CDC25A、CDC2、CCNB1、WEE1的表达均上调,表明G2/M期阻滞可能通过p21/cdc25C/cdc2/cyclin B基因表达的改变而抑制Kasumi-1细胞的增殖。

为了研究DAC处理导致Kasumi-1细胞周期阻滞G2/M期的机制,首先,利用TCGA数据库通过UALCAN系统在线分析,发现在AML患者细胞中和DNMT3a存在负调控关系的基因共541个,其中钙结合蛋白S100A11与DNMT3a存在显著的负调控关系,其在AML中低表达但不显著。

进一步对DAC处理的Kasumi-1细胞进行转录组测序,并将转录组测序中表达上调的基因和TCGA、GEO数据库中的AML较正常骨髓DNA甲基化程度显著降低的基因群,进行交叉分析,发现204个基因在AML骨髓和Kasumi-1细胞中均发生显著变化,其中包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATM。

进一步验证发现,DAC处理后ATM和P53的表达显著上调,显示DAC可能通过改变p53和ATM的表达而促进Kasumi-1细胞G2/M期阻滞和凋亡的作用。