人非小细胞肺癌细胞的复苏与传代及冻存操作说明！

一、背景

人非小细胞肺癌细胞来源于58岁的白人男性肺癌组织，由D.J.Giard等人建立于1972年。M.Lieber发现A549可以通过胞苷二磷酸胆碱途径合成高比例的不饱和脂肪酸卵磷脂。

二、人非小细胞肺癌细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、人非小细胞肺癌细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）人非小细胞肺癌细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37）的完全培养基，继续培养。

2、人非小细胞肺癌细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人非小细胞肺癌细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80过夜后，转入液氮长期保存。

三、应用

人非小细胞肺癌细胞可以用于蜂毒肽对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响和机制研究：

探讨蜂毒肽对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响及其作用机制。

方法：

(1)分别用0 ng/ul、2.5 ng/ul、5 ng/ul、10 ng/ul、20 ng/ul的蜂毒肽处理人非小细胞肺癌A549细胞,CCK8法检测不同浓度蜂毒肽对人非小细胞肺癌A549细胞的增殖活性的影响,并计算IC50;

(2)以0 ng/ul(对照组)和3 ng/ul(MEL组)的蜂毒肽分别处理人非小细胞肺癌A549细胞,细胞克隆形成实验观测蜂毒肽对人非小细胞肺癌A549细胞的克隆形成能力的影响;

(3)构建人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤模型,以瘤内注射100 ul蜂毒肽溶液(剂量5 mg/kg/只)的裸鼠为实验组,瘤内注射等体积生理盐水的裸鼠为对照组,检测两组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量变化;

(4)以0 ng/ul(对照组)和3 ng/ul(MEL组)的蜂毒肽分别处理非小细胞肺癌A549细胞,基于二代测序技术的转录组测序,分析蜂毒肽对人非小细胞肺癌A549细胞基因表达和信号通路的影响。

结果：

(1)蜂毒肽能抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖,在0～10 ng/ul浓度区间内呈剂量依赖关系,在10～20 ng/ul浓度区间抑制作用显著,当浓度达到20 ng/ul时,非小细胞肺癌A549细胞基本全部死亡;

(2)3 ng/ul蜂毒肽能明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞的克隆形成(P<0.05);

(3)瘤内注射100 ul蜂毒肽溶液(剂量5 mg/kg/只)能明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,给药后14天抑制率为41.4%(P<0.001);

(4)转录组测序后共发现差异表达基因1217个,基因功能差异主要富集在细胞迁移的正向调节和血管生成的生物过程中,磷脂酰肌激酶3/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路中差异基因表达显著。

结论：蜂毒肽可能通过调控PI3K-AKT信号通路中相关基因的表达,抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖。