酪蛋白琼脂的培养条件与使用方法及应用！

一、背景

酪蛋白琼脂是一种通用的营养培养基，用于各种微生物的培养，多用于微生物菌落计数培养。

原理：某些细菌产生酪蛋白酶可分解酪蛋白使菌落周围的培养基形成透明圈；牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子；磷酸氢二钠为缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；溴麝香草酚蓝为指示剂染料。

大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)的成分(g/L)：胰蛋白胨15.0g、大豆胨5.0g、氯化钠5.Chemicalbook0g、琼脂15.0g、PH值7.3±0.2。胰酪胨（酪蛋白胰酶水解物）、大豆木瓜蛋白酶水解物提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。

二、使用方法：（平板计数法）

1、称取本品35g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121灭菌15分钟。

2、用时加热溶化琼脂，至50，摇匀后倾注灭菌平皿，冷却后平板呈绿色，有沉淀。

3、取待检菌的新鲜培养物划线接种于平板上，于36±1培养24h。

4、观察结果：蜡样芽孢杆菌能产生酪蛋白酶，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白。

三、培养条件:

无菌检查:20~25培养14天或直至出现浑浊(不超过14天)

MPN计数:30~35培养箱中培养3天

控制菌检查:30~35培养箱中培养18~24小时

倾注计数用的沙氏葡萄糖琼脂培养基平板置20~25培养箱中培养3~5天

四、应用

酪蛋白琼脂可以用于山羊乳酪蛋白抗菌肽稳定性研究及其功能评价：

依据山羊乳酪蛋白抗菌肽研究和应用不足的现状，用木瓜蛋白酶对山羊乳酪蛋白进行酶解得到抗菌肽，通过琼脂稀释法的抑菌试验研究抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、阪崎杆菌这6种致病菌的抑制效果；

以抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌三种菌的抑菌圈直径为指标，探索抗菌肽的光、热、pH稳定性；

以pH值及菌落总数为指标，探索抗菌肽在25和4下对原料乳保鲜效果的影响；通过测定抗菌肽对非洲绿猴肾细胞(Vero)及牛肾细胞（MDBK）的最大无毒剂量、细胞病变效应(CPE)、血凝价、病毒含量等指标，探索其对禽流感病毒H9N2(AIV）及I型牛疱疹病毒(BHV-1)的抑制情况，为山羊乳酪蛋白抗菌肽在食品、药品、化妆品工业中的广泛应用奠定基础。

试验结果如下：

（1）抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、阪崎杆菌等6种致病菌均有一定的抑制作用。

（2）热、光先后处理的山羊乳酪蛋白抗菌肽在对三种菌的抑菌圈直径差异不显著；pH对抗菌肽的影响分为两种情况：在中性和碱性条件下对三种菌的抑菌圈直径差异不显著，但强酸性条件抗菌肽会发生絮凝，使其抑菌圈消失，说明羊乳酪蛋白酶解物在热、光、中性、碱性条件下稳定性良好，但在强酸性条件下不稳定。

（3）用抗菌肽对原料乳保鲜研究结果表明，在25下，菌落总数达到105cfu/g对照组需22h，而加入抗菌肽的样品则需28h，与对照组相比抗菌肽可延长保藏时间6h；在4下，菌落总数到达105cfu/g对照组需33d，而加入抗菌肽的样品则需41d，与对照组相比抗菌肽能延长保藏时间8d。

（4）抗菌肽对Vero细胞及MDBK细胞的最大无毒剂量均为25μg/mL，用不同浓度抗菌肽药物处理AIV及BHV-1，接种敏感细胞后均出现典型CPE，说明抗菌肽对细胞的毒性作用较大，在对细胞无毒剂量范围内抗菌肽对AIV（RNA病毒）及BHV-1（DNA病毒）均无明显抑制作用。