小鼠中脑多巴胺能神经元细胞的应用及培养方法！

一、背景

MN9D小鼠中脑多巴胺能神经元细胞来源于一位72岁的男性结直肠癌患者的肺部转移灶；皮下接种至BALB/c裸鼠并连续传代23次后建立该细胞系。在裸鼠身上传代的过程中，该肿瘤仍保持原始的结直肠癌的组织学特性。该细胞有多种肽类激素和神经递质的受体，维持电解质的定向运输。

二、细胞培养步骤

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于mTOR信号通路在雷帕霉素调控锰诱导MN9D细胞凋亡中的作用研究：

以小鼠中脑多巴胺能神经元细胞（MN9D）为模型,探讨雷帕霉素在调控锰诱导MN9D细胞凋亡中的作用及可能机制,探讨mTOR信号通路在雷帕霉素调控锰诱导MN9D细胞凋亡中作用及其可能机制,为防治职业人群锰中毒提供研究基础。

方法：

1、MN9D细胞在雷帕霉素（0.1μg/ml）预处理1h后分别暴露1.2和2.4m M锰24h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色计数活细胞数量、Annexin V/PI双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡率、Western blot分析MN9D细胞caspase-3激活程度。

2、MN9D细胞在雷帕霉素RAP（0.1μg/ml）/mTOR激动剂MHY（1μM）预处理1h后暴露1.2 m M锰24h。然后,观察细胞形态、台盼蓝染色计数活细胞数量、Annexin V/PI双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡率、western blot分析MN9D细胞caspase-3激活和mTOR相关蛋白变化。

结果：

1、与对照组相比,锰以浓度依赖的方式诱导MN9D细胞活性下降和形态改变,凋亡率逐渐升高,cleaved-caspase-3蛋白表达量也逐渐升高,差异有统计学意义（P<0.05）。而与染锰组相比,雷帕霉素预处理能够明显削弱锰诱导的MN9D细胞活性下降和调亡表现,阻滞锰诱导caspase-3激活,差异有统计学意义（P<0.05）。

2、与对照组相比,单独染锰组MN9D细胞活性下降和形态改变,凋亡率增加,差异有统计学意义（P<0.05）;cleaved-caspase-3蛋白表达量增加,差异有统计学意义（P<0.05）;AKT和和S6K1、4E-BP1蛋白磷酸化表达量增加,差异有统计学意义（P<0.05）。