枯草芽孢杆菌的作用机制与培养方法及应用领域！

一、菌种简介

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）,为革兰氏阳性菌，广泛存在不同环境中的一种需氧菌，其在土壤及腐败的有机物，植物表面普遍存在，易在枯草浸汁中繁殖生长，在人和动物肠道内亦发现共生。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一种，直杆状，单个细胞（0.7-0.8）*（2-3）μm，无荚膜，周生有鞭毛，能运动，可形成内生抗逆芽孢，大小为（0.6-0.9）*（1-1.5）μm，稍小于原菌体，主要位于中央，芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面呈污白或微黄色，粗糙不透明，易扩张。枯草芽孢杆菌具有生殖生长期、孢子休眠期两个时期，在环境恶劣、营养物质缺乏时进入孢子休眠期，形成具有极强抗逆作用，高温、酸碱等极性环境下亦可生存的芽孢。一旦环境变得适宜生长、营养充足，芽孢会自动复苏进入生殖生长期。

二、作用机制

1、枯草芽孢杆菌生长过程中产生的伊枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、杆菌肽等多肽类活性物质和生物表面活性素等，对致病菌有明显的抑制作用。

2、枯草芽孢杆菌自身能够合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。

3、枯草芽孢杆菌是好氧菌，能迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。

4、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高免疫力。

三、培养方法

枯草芽孢杆菌菌剂的生产关键技术在于发酵培养。发酵培养的优化改良涉及提高菌株生长繁殖速度及抗菌物质的分泌量两个方面，可以通过发酵条件如pH值、温度、通气条件及发酵配方的优化来实现，不同的菌株所需的条件也各异。

如其中BaillussubtilisB-916在3~33、pH7.0~8.5时，均能生长良好，且初始接种量对B-916的生长有明显的影响。研究表明多数生防枯草芽孢杆菌在含大豆水溶物的培养基或土壤中生长良好，且分泌较多的抗菌物质。菌株操作应在无菌条件下进行，防止杂菌污染。

1、斜面菌苔转接方法：将配套液体培养基倾入斜面试管中并使用无菌接种环将菌苔刮取于液体中，将含有菌苔的液体培养基倒回原始管中，振荡使菌苔分布均匀。将无菌棉拭子充分浸入菌悬液，并涂布平板1/5~1/3区域，使用接种环交叉划线涂布区域使形成单菌落。

2、液体培养物转接方法：使用无菌吸管去除液体表面的液体石蜡，振荡混匀液体培养物，将无菌棉拭子充分浸入菌悬液，并涂布平板1/5~1/3区域，使用接种环交叉涂布区域划线使形成单菌落。培养基：营养琼脂、细菌保存培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基。

四、应用范围

1、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖、水产养殖。

2、作为微生物农肥，在农业生产中具有重要作用。

3、工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理。

五、应用领域

1、在植物生防方面的应用

枯草芽孢杆菌对植物病虫害具有一定的防治作用，与传统的化学农药相比，对人畜无毒无害，不污染环境，高效广谱，无抗逆性。枯草芽孢杆菌目前已被制成粉剂可湿性粉剂等被应用，运用枯草芽孢杆菌制成的可湿性粉剂喷施于茶树上，不仅可提高机体的免疫能力，还具有明显的提质增产作用。研究表明，枯草芽孢杆菌可有效防治草莓白粉病，可提高作物品质和产量；将枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进行细胞融合获得了具有抑菌杀虫作用的融合子CF103，田间试验结果显示，CF103能兼治水稻纹枯病和稻纵卷叶螟；枯草芽孢杆菌TF26可抑制葵花菌核病菌、番茄和黄瓜枯萎病菌、黄瓜菌核病菌、立枯病菌水稻恶苗病菌和大豆根腐病菌等13种植物病原真菌的生长，由于微生物发酵易大规模生产，解决了实际生产中对原料提取的依赖性，降低了防治成本，因此，枯草芽孢杆菌在植物生防领域的应用具有广阔前景。

2、在畜禽养殖方面的应用

枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的2种芽孢杆菌之一。研究表明，在肉鸡的基础日粮中添加枯草芽孢杆菌生物制剂后，能够明显改善鸡肉品质及氨基酸组成，显著提高肉鸡的净增重日增重采食量和饲料转化率。另外，枯草芽孢杆菌可有效防治消化道疾病，可代替抗生素预防仔猪腹泻症，对于促进动物营养的消化吸收提高动物的饲料转化率防治疾病和促进生长有重要作用。

3、在医药方面的应用

枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶具有产量高种类多安全性好不污染环境等特点，广泛运用于医药领域，其中主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶（纳豆激酶）和脂肪酶2种丝氨酸纤溶性蛋白酶具有显著的溶栓作用，能促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂，表现出潜在的溶栓活性，其具有不易引起出血无抗原性半衰期长安全无毒且成本低廉和能口服吸收等优点，能够预防脑血栓及心梗死病的发生。

4、在工业领域的应用

枯草芽孢杆菌的降解活性主要运用在食品加工方面，已在骨素加工水解生产大豆蛋白和大豆肽乳制品生产等工业过程中得到广泛应用。枯草芽孢杆菌在石油采收方面也有应用，从印度发酵食品中分离出的枯草芽孢杆菌20B在葡萄糖培养基上生成的表面活性剂（含脂肪烃和肽）可使培养基的表面张力减少，使十六烷和油的界面张力减少，在油的回收中具有良好的应用前景。洗涤剂中使用的蛋白酶一般来源于枯草芽孢杆菌，最近借助蛋白工程学技术，开发了具有耐氧化剂和低温下活性高对洗涤剂和洗涤环境适应性好的变异性酶，并已被商品化。

5、在其他领域的应用

在环境保护方面，枯草芽孢杆菌在湖泊水库等微污染水体的净化及修复方面有一定的应用。此外，枯草芽孢杆菌在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解吸收水及底泥中的蛋白质淀粉脂肪等有机物，可除去水中的氨氮和硝基氮，有效降低水体富营养化和清除水底污泥，有利于维持生态平衡，促进虾蟹的生长繁殖，在水产养殖中应用广泛。

六、存在问题

植物病害生防枯草芽孢杆菌的研究开发应用目前已取得了令人瞩目的成就，但其发展过程中仍存在不少问题，其中突出的有以下几个方面：

1、枯草芽孢杆菌的产业化应用尚不成熟，首先是在医药方面，我们尽管已经证明枯草纤溶酶具有良好的溶血栓效果，但是在国内相应的商品化的药品却不多见，而且枯草脂肪酶用于制作相应的药物还不成熟，有待进一步研究。

2、其次，在农业方面一些相应的生物农药和饲料也没有得到大范围的应用，这主要是由于科技的不均衡性和理论转化为实际的考察期较长造成的，与一般的传统饲料添加剂不同，枯草芽孢杆菌的使用是建立在微生态学理论基础上的，因此用于直接饲喂或饲料加工时，应充分考虑畜禽体内的微生态平衡，使其真正起到调节体内微生态的作用，而不是单纯将其作为一种药物或营养源使用，而且枯草芽孢杆菌调节微生态平衡的研究多数局限于效果水平，对其作用机理的揭示仍有不足。

3、最后，枯草芽孢杆菌自身也有需要克服的问题枯草芽孢杆菌虽然可以直接作用于农业来抗一些植物病虫害，然而，天然野生型微生物菌剂存在天生的不足，如产品持效期短，见效慢，作用对象比较单一，易受自然环境影响，竞争存活能力有限等。

七、展望

尽管枯草芽孢杆菌在应用过程中还存在一些问题，但枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求，而且枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究也已经积累了丰富的研究资料，具有重要的理论意义和指导生产价值。随着现代生物技术的广泛应用，基因组学和蛋白组学的发展，以及先进的仪器设备的应用，枯草芽孢杆菌对植物病害的生防作用研究及其开发应用也会出现新的发展，枯草芽孢杆菌制剂可以与化学农药复配，实现优势互补，用量减少，防效增强的目的；并可与其它拮抗菌混合使用，实现多种抗生菌功能互补，多种病害兼防，作用持久的协同防治的效果，这两方面均有很广的发展潜力。枯草芽孢杆菌对环境有很强的抗逆能力，同时对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有很好的开发前景。随着对枯草芽孢杆菌及其产生的有效抗菌物质的深入研究，其植病生防优势越来越明显，并展现出广阔的应用前景。但是，与国际前沿相比，我国在对枯草芽孢杆菌基因组和蛋白质组学方面的研究还有待进一步深入，产业开发也有待进一步加强。