人脂肪间充质干细胞的背景与应用及培养操作步骤！

一、背景

人脂肪间充质干细胞是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在诱导条件下可以分化成为神经细胞、免疫细胞、胰岛细胞、肌细胞、肝细胞、软骨细胞、基质细胞。脂肪间充质干细胞，取材容易，脂肪中干细胞浓度高出骨髓500倍以上，细胞性状较其他干细胞培养更加稳定，安全可靠，分化能力强大，可以分化为各个系统的功能细胞。而且脂肪干细胞不会根据人的年龄增长而活性下降，相对比其他来源的干细胞，脂肪干细胞更加稳定。

二、培养操作

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类;

1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人脂肪间充质干细胞可以用于炎症环境中PD-L1在人脂肪间充质干细胞上的作用：

采用人脂肪间充质干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)为研究对象,通过用10 mg/L的脂多糖(LPS)刺激细胞来构建体外炎症模型,研究内容包括以下四个方面:

(1)采用qRT-PCR、Western blot和IF法检测hADSCs中PD-L1的表达情况。

(2) 探究炎症环境中PD-L1表达水平对hADSCs迁移能力的影响。采用细胞划痕和Transwell实验检测hADSCs的迁移能力,qRT-PCR检测趋化因子的表达。

(3) 探究炎症环境中PD-L1表达水平在hADSCs对B细胞免疫调节中的作用。采用CCK-8法检测B细胞增殖能力,ELISA法检测B细胞分泌IgG能力。

(4)探究PD-L1在hADSCs中的表达调控机制,采用qRT-PCR法检测hADSCs中可能调控PD-L1表达的基因在m RNA水平的变化。

结果显示：(1)10 mg/L LPS刺激细胞后,hADSCs中PD-L1的基因转录水平和蛋白表达显著升高。

(2)10 mg/L LPS刺激细胞后,hADSCs的迁移显著增强,细胞趋化相关因子的m RNA相对表达量都显著升高。但在转染了siRNA-PD-L1后,hADSCs的迁移被抑制,CXCR4的m RNA相对表达量显著降低。

(3)共培养组中,hADSCs抑制了B细胞的增殖和分泌IgG的能力;转染了siRNA-PD-L1后,hADSCs对B细胞的抑制效应被部分逆转。

(4)10 mg/L LPS刺激细胞后,hADSCs中PD-L1和NF-κB的基因转录水平都显著升高;加入NF-κB的抑制剂后,hADSCs中PD-L1和NF-κB的表达显著降低。

综上所述,本实验利用hADSCs体外炎症环境模型探究了PD-L1在MSCs治疗和减缓炎症中的作用,发现炎症环境中PD-L1高表达促进hADSCs的迁移和对B细胞的免疫抑制作用,同时转录因子NF-κB参与了hADSCs上PD-L1的表达调控。表明可通过添加炎性因子预处理或基因修饰过表达PD-L1来提高MSCs的归巢率和免疫抑制功能,为进一步应用MSCs治疗炎症性疾病奠定了研究基础。