小鼠肌酐(CR)ELISA试剂盒的背景与应用！

一、背景

小鼠肌酐(CR)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠肌酐(Cr)的含量。

二、实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被小鼠肌酐(Cr)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠肌酐(Cr)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

三、样品收集、处理及保存方法

1)血清操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2)血浆EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3)细胞上清液1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4)组织匀浆将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液。

四、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3、样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

4、除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6、每孔加入底物A、B各50μL,37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

五、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。

六、应用

用于马兜铃酸I致乳鼠和成年小鼠的毒性比较研究及活血化瘀方对其防治作用初探：

利用乳鼠和成年小鼠综合评价马兜铃酸I（aristolochic acid I,AAI）的毒性差异,为马兜铃酸临床辩证用药,安全合理应用提供一定的科学依据。

方法：

1、利用乳鼠和成年小鼠评价AAI毒性研究。研究分为乳鼠正常对照组,乳鼠AAI 2.5 mg/kg组,乳鼠AAI 5 mg/kg组,成年小鼠正常对照组,成年小鼠AAI 2.2 mg/kg组,成年小鼠AAI 4.4 mg/kg组,每组15只,连续给药5天。观察AAI致乳鼠和成年小鼠的死亡情况;收集血清进行肝脏、肾脏和心脏功能指标检测;采集肝脏、肾脏和心脏组织样本进行HE染色,比较脏器损伤差异。

2、AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠体内代谢差异研究。研究分为乳鼠正常对照组,乳鼠AAI 22.9 mg/kg组,成年小鼠正常对照组,成年小鼠AAI 20 mg/kg组,腹腔注射AAI溶液一次。实验开始后第2、4、6、8、10、12和24小时眼球取血,并在对应时间点收取尿液,每个时间点乳鼠和成年小鼠每组3只。采用lc-ms/ms检测方法,检测AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠血和尿中的浓度差异,进一步解释AAI导致不同年龄段小鼠毒性差异的原因,并为临床治疗因服用含AAI相关制剂诱发的疾病提供相应的科学依据。

3、评价活血化瘀方对AAI致成年小鼠肝、肾毒性的治疗作用研究。将成年小鼠随机分为4组,每组10只:对照组,模型组,活血化瘀方低剂量组、活血化瘀方高剂量组,模型组腹腔注射AAI 4.4 mg/kg,连续给药5天,低剂量组,高剂量组分别灌胃7.5 g/kg、15 g/kg的活血化瘀方,连续给药14天,实验过程中观察实验动物整体情况;收集血清进行肝脏和肾脏功能指标检测;采集肝脏和肾脏组织样本进行HE染色,比较脏器损伤差异。

结果：

1、利用乳鼠和成年小鼠评价AAI毒性研究。实验动物死亡情况:成年小鼠AAI 2.2 mg/kg组第8天出现死亡,最终死亡率为53.3%,成年小鼠AAI 4.4mg/kg组第6天出现死亡,最终死亡率为100%,而乳鼠组均未发生死亡。血清学检测结果显示,与正常对照组相比,AAI 2.2 mg/kg组、AAI 4.4 mg/kg组成年小鼠肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）均显著升高,且AAI 4.4 mg/kg组高于AAI 2.2 mg/kg组（p<0.05）,其中Cr和BUN升高最为显著,但乳鼠组各项指标均未明显改变;HE染色结果显示,AAI可导致成年小鼠急性肾小管坏死,肾小管和间质显著扩张;肝小叶部分细胞核溶解和核破碎;心肌淤血,部分心肌纤维坏死,成年小鼠AAI4.4 mg/kg组损伤程度高于AAI 2.2 mg/kg组,其中肾脏损伤最为严重,肝脏和心脏损伤相对较轻,而AAI对乳鼠的肾脏、肝脏和心脏并无明显损伤。

2、AAI和AAT在乳鼠和成年小鼠体内代谢差异研究。实验给药后2 h迅速达到峰浓度,在峰浓度时,AAI在乳鼠血中的浓度只有成年小鼠的55.9%,随后呈同等趋势下降,在尿中AAI的浓度变化趋势和血中相一致;AAT在乳鼠和成年小鼠血中达峰时的浓度无明显差异,但在尿中差异显著,达峰时乳鼠尿中AAT的浓度只有成年小鼠的35.1%。

3、评价活血化瘀方对AAI致成年小鼠肝、肾毒性的治疗作用研究。实验动物整体情况:成年小鼠AAI 4.4 mg/kg组第6天出现死亡,最终死亡率为100%,而活血化瘀方7.5 g/kg、15 g/kg组分别从第8天和第10天出现死亡,最终存活率分别为30%和50%,实验期间活血化瘀方治疗组小鼠体重逐渐增长,生命力更加旺盛,毛发更加光滑,行动力也更强。血清学检测结果显示,与对照组相比,模型组成年小鼠肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平显著上升（p<0.05）,而活血化瘀方15 g/kg组治疗后上述指标均显著下降（p<0.05）;HE染色结果显示,与对照组相比,模型组小鼠肾小管坏死严重,淋巴细胞明显浸润;肝小叶多数肝细胞核溶解和核破碎,少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润,与模型组相比,活血化瘀方15 g/kg组肾小管损伤程度明显减轻,淋巴细胞浸润减少;而肝小叶部分细胞核溶解和核破碎,炎性细胞浸润减少。