人肺退行性癌细胞的背景与应用及相关研究！

一、背景

人肺退行性癌细胞是指从机体的组织或器官经胰蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体环境培养的细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子生物学、细胞生物学和生物医学基础研究，还可应用于当今热门的生物医药产业，如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。

二、人肺退行性癌细胞培养步骤

1、人肺退行性癌细胞培养基及培养冻存条件准备

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人肺退行性癌细胞可以用于Aurora-A/PLK1双靶点抑制剂的设计、合成及活性筛选：

基于Aurora-A和PLK1抑制剂均能够阻止中心体成熟和双纺锤体的形成等有丝分裂过程中的相似和协作效应,且单独对Aurora-A和PLK1激酶进行抑制时也均能使肿瘤细胞的有丝分裂被阻滞,达到阻断癌细胞复制功能等特点,再结合已有的吡唑[3,4-b]吡啶类Aurora-A抑制剂的母核关键作用模式,运用基于分子片断的母核虚拟筛选和基于受体结构的支链设计相结合的计算机辅助药物设计方法,寻找到一个以6-氨基-2-萘甲酸为母核的新颖Aurora-A/PLK1双靶点抑制剂骨架结构。接着再设计了针对6-氨基-2-萘甲酸类化合物的最简合成路线并通过化学合成和核磁质谱鉴定得到了35个该系列的实体化合物。

而后对该35个化合物在人肺退行性癌细胞(Calu-6)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人非小细胞肺癌细胞(A549)中进行了初步体外抗肿瘤活性筛选,最终在这些化合物中发现了一些抗肿瘤效果良好的抑制剂,其中抗肿瘤活性最好的化合物C5对癌细胞HCT116、Calu-6、A549、MCF-7的半数抑制浓度分别达到了2.0μM、5.5μM、1.6μM、6.2μM,其有望成为我国具有自主知识产权的抗肿瘤新药候选药物。