小鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA KIT的应用！

一、背景

小鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中5核苷酸酶(5-NT)水平。

原理：用纯化的5核苷酸酶(5-NT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入5核苷酸酶(5-NT)，再与HRP标记的5核苷酸酶(5-NT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的5核苷酸酶(5-NT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中5核苷酸酶(5-NT)浓度。

二、小鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA KIT操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、应用

用于血清5’-NT、TBA、GGT及ALT检测在肝脏疾病中的临床价值研究：

探讨血清5’-核苷酸（5’-NT）、总胆汁酸（TBA）、γ,-谷氨酰基转移酶（GGT）丙氨酸氨基转移酶（ALT）的检测在肝脏疾病中的临床价值。

方法：采用美国贝克曼AU5821全自动生化分析仪,测定各肝病组和正常对照组血清5’-NT、TBA、GGT、ALT含量。结果：各组肝病患者5’-NT、TBA、GGT、ALT值均明显高于正常对照组（P＜0.01）。5’-NT值在慢性病毒性肝炎组和肝硬化组、肝癌组的比较中,差异有统计学意义（P值均＜0.05）。TBA值在慢性病毒性肝炎组和肝硬化组、肝硬化组和肝癌组的比较中,差异有统计学意义（P值分别为＜0.05和＜0.01）。GGT值在慢性病毒性肝炎组和肝癌组、肝硬化组和肝癌组的比较中,差异有统计学意义（P值分别为＜0.01和＜0.05）。

ALT值在慢性病毒性肝炎组和肝硬化组、肝癌组的比较中,差异有统计学意义（P值均＜0.01）。

结论：ALT值不能完全反映患者的病情轻重,尤其不能反映肝组织病理学损伤情况,低水平的ALT值可看作是慢性病毒性肝炎并发肝硬化、肝癌的危险因素。5’-NT和GGT持续增高对于监测慢性病毒性肝炎并发肝硬化、肝癌具有一定的临床价值。而对于慢性病毒性肝炎、肝硬化患者,GGT大幅增高时应警惕肝癌的发生。TBA可较为敏感的反映肝硬化患者的分泌、合成代谢功能。血清5’-NT、TBA、GGT可较为灵敏的反映肝细胞损伤及肝功能障碍程度,对于肝脏疾病的诊断及鉴别诊断、疗效监测、预后判断具有较高的临床应用价值。