永生化人视网膜微血管内皮细胞的培养操作步骤！

 

 

一、细胞简介

人视网膜微血管内皮细胞分离自视网膜组织；视网膜居于眼球壁的内层，是一层透明的薄膜。视网膜由色素上皮层和视网膜感觉层组成，两层间在病理情况下可分开，称为视网膜脱离。色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞组成，它们具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。

 

二、产品信息

平台编号：Bio-132168

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：HRMECs

产品简称：HRMECS

中文名称：永生化人视网膜微血管内皮细胞

细胞数量：1*10^6

组织来源：人，眼睛，视网膜

形态特征：内皮细胞样

生长方式：贴壁生长

背景描述：原代的人视网膜微血管内皮细胞转入SV40和hTERT基因得到的永生化细胞

培养条件：ECM；空气95%，二氧化碳5%；37培养

换液频率：2-3天

传代比例：1:3

冻存液配方：95%完全培养基，5%DMSO

安全性：BSL-1

供应限制：仅供科研

运输方式：常温运输（T25培养瓶）

用途：STR鉴定正确

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

 

三、细胞特性

1)组织来源于人的正常眼组织。

2)细胞鉴定：血小板-内皮细胞粘附分子（PECAM-1/CD31）或血管假性血友病因子（vWF）免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：呈鹅卵石样，不规则细胞，贴壁培养。

 

四、细胞操作详细步骤（贴壁细胞）

1、细胞复苏

1.1 离心法

1.1.1 准备一个 T25 的细胞培养瓶并做好标记，预热好的细胞完全培养基，一支 15ml离心管，离心管中加入 4-5ml 细胞完全培养基。

1.1.2 取出细胞冻存管，在 37 度水浴中快速解冻，将管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.1.3 将细胞悬液转移到加有培养基的离心管中，1000 转离心 5 分钟。

1.1.4 倒掉上清，加入培养基轻轻重悬细胞亦可先将细胞团弹散后加入培养基混匀。

1.1.5 将重悬好的细胞转移到 T25 细胞培养瓶，补充培养基到 8ml 左右，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养。

1.2 不离心法

1.2.1 准备一个 T25 的细胞培养瓶并做好标记，预热好的细胞完全培养基，培养瓶中加入 8ml 左右培养基。

1.2.2 取出细胞冻存管，在 37 度水浴中快速解冻，将管子擦干并消毒后迅速拿回生物安全柜。

1.2.3 将细胞悬液转移到加有培养基的培养瓶中，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养，接种 16 小时后更换培养基。

2、细胞传代

2.1 准备细胞完全培养基，细胞培养瓶，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

2.2 弃上清，并加 2-3mlDPBS 轻柔冲洗培养瓶内细胞 1-2 次。

2.3 加入 1ml 胰酶，室温或者 37 度消化，直到细胞成片脱落，加入 3-4ml 完全培养基终止消化，如果有成团块脱落的细胞可轻轻吹打分散细胞后再终止消化。（注意：消化时间与所用胰酶效价，消化时候细胞密度以及温度等因素有关，建议第一次消化时候，多在显微镜下观察，以找到最佳消化时间）

2.4 收集细胞悬液，1000 转离心 5 分钟，弃上清，加入培养基轻轻重悬细胞亦可先将细胞团弹散后加入培养基混匀。

2.5 将重悬好的细胞按比例分装至 T25 细胞培养瓶，补充培养基到 8ml 左右，十字摇晃，将细胞铺匀后放入培养箱培养。

3、细胞冻存

3.1 准备细胞冻存液，细胞冻存管，胰酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA），DPBS。

3.2 弃上清，并加 2-3mlDPBS 轻柔冲洗培养瓶内细胞 1-2 次。

3.3 加入 1ml 胰酶，室温或者 37 度消化，直到细胞成片脱落，加入完全培养基终止消化，如果有成团块脱落的细胞可轻轻吹打分散细胞后再终止消化。

3.4 收集细胞悬液，1000 转离心 5 分钟，弃上清。

3.5 加入冻存液，重悬细胞，并分装到冻存管，冻存密度 0.8-1.5×106细胞/ml。

3.6 将冻存管放入程序降温盒，并放到-80冰箱，过夜后将冻存管转移到液氮保存。

4、注意事项

4.1 建议收到细胞后先用我们配套的培养基和血清。收到活细胞的客户培养瓶中的培养基可回收使用，保存在 4 度可使用一周。

4.2 不同实验室操作上会有些许差异，为了避免细胞不适应，请先按照说明书推荐的方法和操作步骤培养，待细胞冻存后可根据自己的习惯操作看细胞是否能够适应。

4.3 建议收到细胞后，前几代及时冻存一些细胞，并最好是可以多冻存几个批次。

4.4 该细胞的完全培养基为 5%血清，为避免终止消化不完全，可以用其他含 10%血清的培养基，比如 DMEM 或者 1640，也可用专门的胰酶终止液。

 

五、hRMECs (人视网膜微血管内皮细胞)接收后的操作流程与注意事项

1、细胞收到后建议在培养箱稳定4小时左右再依据细胞密度，换液培养或传代。

2、如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞及时离心，加15%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶中继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为15%血清的完全培养基，培养2-3天。若3天后细胞都没有出现增殖而是继续脱落死亡，请及时联系实验室，技术人员会跟进解决。

3、贴壁细胞生长缓慢：适当提高血清浓度（最高不超过20%），或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养。

4.、生长不均：贴壁细胞若出现生长不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重新打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。

 

六、hRMECs (人视网膜微血管内皮细胞)常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）

1、吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25% EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2、镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml 完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3、取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4、注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

 

七、hRMECs (人视网膜微血管内皮细胞)特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）

1、收到细胞后请尽快更换为含10% FBS的新鲜培养基，切勿使用原瓶中运输用培养基。

2、如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系实验室。

3、细胞任何售后问题，均需拍照存档并及时联系客服。