人胎盘绒毛膜细胞的背景与应用及传代方法！

一、背景

人胎盘绒毛膜细胞分离自胎盘组织；胎盘（placenta）是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官，由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还产生多种维持妊娠的激素，是一个重要的内分泌器官。有些爬行类和鱼类也以胎生方式繁殖后代，胚胎生长出一些辅助结构如卵黄囊、鳃丝等与母体组织紧密结合，以达到母子间物质的交换，这样的结构称假胎盘。

绒毛膜是由滋养层和胚外中胚层的壁层构成。胚泡植入子宫内膜后，在胚泡表面形成许多绒毛样的突起，以细胞滋养层为中轴，外裹合体滋养层，称初级干绒毛。胚外中胚层长入初级干绒毛的中轴，使初级干绒毛变成了次级干绒毛。当绒毛膜的胚外中胚层内形成血管网和结缔组织，并与胚体内的血管相通时，次级干绒毛改称三级干绒毛。三级干绒毛末端的细胞滋养层细胞形成细胞滋养层壳。随着胚胎发育，丛密绒毛膜与基蜕膜共同构成了胎盘，而平滑绒毛膜则和包蜕膜一起逐渐与壁蜕膜融合。

人胎盘绒毛膜细胞采用胰蛋白酶-DNA酶联合消化法结合密度梯度离心法制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经hCG免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

二、人胎盘绒毛膜细胞传代步骤

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

人胎盘绒毛膜细胞可以用于DC-SIGN、DC-SIGNR在人胎盘绒毛组织及原代培养滋养层细胞中的表达及意义研究：

原代培养人绒毛膜滋养层细胞,观察其生物学特性;研究DC-SIGN、DC-SIGNR人胎盘绒毛组织中定位以及在体外培养滋养层细胞上的表达;为进一步探讨宫内传播机制中的受体介导途径提供体外实验基础。

主要方法及结论如下：

1、取正常早孕孕妇绒毛组织,采用胰蛋白酶/Dnase酶序贯消化法消化分离细胞,以35%、45%两个Pcrcoll密度梯度离心及换孔的方法纯化细胞,置于高糖DMEM培养液+20%胎牛血清培养体系中,调整细胞密度为5×10~5/ml,37、5%CO2饱和湿度下培养。细胞存活率近95%。贴壁细胞形态多样,呈不规则多角形或卵圆形,胞浆透明,核大椭圆形。免疫细胞化学染色结果显示,近90%培养细胞的细胞角蛋白染色阳性,有少数波形蛋白阳性细胞。

2、免疫组织化学方法、逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)、免疫印迹法(Western-Blot)分别检测不同孕期正常胎盘绒毛组织及体外培养滋养层细胞上DC-SIGN、DC-SIGNR的表达。DC-SIGN主要表达于胎盘滋养层细胞和胎盘微血管内皮细胞的胞核,胎盘Hofbauer细胞的胞膜;DC-SIGNR则主要表达于胎盘滋养层细胞、Hofbauer细胞及胎盘微血管内皮细胞的胞膜及胞浆,在原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中DC-SIGN、DC-SIGNR的表达与在体组织的表达一致。

综上所述,建立了稳定的滋养层细胞原代培养体系,并采用免疫组化法、RT-PCR、Western-Blot分别从分子水平和蛋白水平证实了DC-SIGN、DC-SIGNR在胎盘滋养层细胞中均有表达,并明确了其表达部位。这为研究滋养层细胞上受体介导的宫内感染机制提供了体外实验的细胞学基础。