大鼠胰岛素瘤细胞的复苏操作要点及应用！

一、背景

大鼠胰岛素瘤细胞分离自大鼠胰岛素瘤组织是指从机体的组织或器官经胰蛋白酶、胶原酶、中性蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体环境培养的细胞。

胰岛素瘤指因胰岛β细胞瘤或β细胞增生造成胰岛素分泌过多，进而引起低血糖症；其胰岛素分泌不受低血糖抑制。低血糖症是一组由多种病因引起的以血糖浓度低为特点的综合征，一般以静脉血浆葡萄糖浓度（葡萄糖氧化酶法测定）<2.8mmol/L（50mg/dl）作为低血糖症的诊断标准；临床症状和体征主要为交感神经系统兴奋和中枢神经系统受抑制表现。

二、大鼠胰岛素瘤细胞复苏操作要点

1、将培养基在37水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2、将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4、800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6、第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

三、应用

用于α-硫辛酸对亚砷酸钠诱导大鼠胰岛素瘤细胞自噬性死亡的保护作用及机制研究：

探讨自噬在亚砷酸钠（NaAsO2）诱导大鼠胰岛素瘤（INS-1）细胞死亡过程中的作用及分子机制

方法：1、NaAsO2诱导INS-1细胞自噬性死亡研究实验:以INS-1细胞为研究对象,实验设空白对照（Ctrl）组,不同浓度NaAsO2组（120、60、30、15、5μmol/L）,

（1）采用CCK8法检测不同浓度NaAsO2作用INS-1细胞24 h后INS-1细胞的增殖抑制率,根据CCK8实验结果,采用NaAsO2（30、15、5μmol/L）三个浓度为染砷浓度进行后续实验研究。

（2）通过透射电子显微镜观察INS-1细胞超微结构;

（3）通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染质粒GFP-LC3后INS-1细胞内荧光的表达;

（4）设空白对照组、NaAsO2组（30、15、5μmol/L）、自噬抑制剂氯喹组（CQ,10μmol/L）、CQ与NaAsO2合用组（CQ+NaAsO2 30μmol/L）作用INS-1细胞24 h后采用Western-Blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表达。

2、α-LA对NaAsO2致INS-1细胞自噬性死亡过程的保护作用实验研究:以INS-1细胞为研究对象,根据实验1结果选择NaAsO2浓度30μmol/L建立INS-1细胞自噬损伤模型,实验设空白对照组、模型组（NaAsO2 30μmol/L）组及α-LA（200、100、50μmol/L）预处理组,预处理时间为用NaAsO2造模前3h,按分组处理INS-1细胞24h后。

（1）采用CCK8比色法检测INS-1细胞的增殖抑制率;

（2）通过透射电子显微镜观察INS-1细胞超微结构;

（3）通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染质粒GFP-LC3后INS-1细胞内荧光的表达;

（4）通过Western-Blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表达。

结果：1.NaAsO2诱导INS-1细胞自噬性死亡研究实验结果:

（1）NaAsO2能够明显抑制INS-1细胞的增殖,经NaAsO2作用24 h后的IC50为23.28μmol/L。

（2）通过透射电镜观察NaAsO2组INS-1细胞中可见双层膜自噬小体与自噬空泡生成。

（3）转染质粒GFP-LC3后NaAsO2组激光扫描共聚焦显微镜下可见INS-1细胞中绿色点状荧光聚集增多。