HBMEC人脑微血管内皮细胞的传代培养及应用！

一、背景

HBMEC人脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。

二、培养维持

1、应用冰冻的细胞构建培养物后，可于次日早晨更换新鲜的含有添加物的培养基。随后的传代培养中，每隔48小时更换一次培养基。

2、此后每隔一天更换一次培养基，直到细胞约达到50%融合。

3、一旦细胞达到50%融合，则要每天更换培养基直到细胞大约达到90%融合。

三、传代培养

1、细胞达到90%融合时进行传代培养。

2、传代培养的前一天准备纤维连接蛋白包被的培养瓶(2μg/cm2)。

3、将培养基，胰酶/EDTA消化液，胰酶中和液和DPBS(磷酸盐缓冲液)加热至室温。我们不推荐在使用前用37°C水浴加热试剂和培养基。

4、用DPBS冲洗细胞。

5、用10 ml胰酶/EDTA消化液消化细胞(以T-75培养瓶为例)，直到80%细胞呈现圆形(在显微镜下观察)。立刻加入10 ml胰酶中和液并轻轻摇动培养瓶。

注意：应用ScienCell研究室的胰酶/EDTA消化液能使由于过度消化导致的细胞死亡降到最小程度。

6、收取细胞并将其移入50ml离心管中。另外用10ml生长培养基冲洗培养瓶以收集残留的细胞。在显微镜下观察剩余细胞数量以确定是否收集成功。剩余细胞数应小于5%。

7、以1000转/分（1000rpm）离心收取的细胞悬液5分钟，然后在生长培养基中重悬细胞。

8、计数细胞，然后将它们以推荐的细胞密度接种在新的纤维连接蛋白包被过的培养瓶中。

四、应用

用于人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养体外血脑屏障细胞模型的建立研究：

血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）是位于中枢神经系统与血液循环系统之间具有一定的限制物质通过能力、调节和维持中枢神经系统微环境稳定的屏障结构。主要由脑微血管内皮细胞、型星形胶质细胞足板及血管基膜组成,完整的血脑屏障具有特殊的酶系统、低水平的细胞内吞、以及一定选择性的物质转运功能。猪链球菌（Streptococcus suis,）,为链球菌属（Streptococcus）的直径1～2μm单个或卵圆形、液体培养中呈短链状的革兰阳性球菌。

根据荚膜抗原的差异,猪链球菌可分为多个血清型以及相当数量未定型菌株。猪链球菌是一种重要的致脑膜炎细菌,但已有的研究还无法揭示猪链球菌如何穿透血脑屏障并引致宿主动物脑膜炎,缺乏一种从分子和细胞层面研究猪链球菌穿透血脑屏障的模型工具。

随着近几年体外细胞培养技术和材料工艺的发展和进步,通过模拟体内环境来研究内皮细胞跨膜物质转运、离子信号通路、蛋白表达机制已成为可能。利用此类细胞培养技术,我们可以有条件的在体外重建血脑屏障,通过构建基因突变株、黏附试验等方法,借助免疫荧光技术、电镜技术等手段观察细菌与细胞的互相作用,有助于血脑屏障的进一步研究。

本研究使用Transwell细胞培养小室作为载体构建体外血脑屏障模型,利用人脑微血管内皮细胞和人正常星形胶质细胞构建三种血脑屏障模型。通过测定跨内皮阻抗（TEER）和荧光素钠（FLU）通透性来评价血脑屏障模型的构建效果。TEER值测定结果显示:在第5天时,共培养屏障模型可达143Ωcm2,单层hBMEC屏障模型为137Ωcm2,而单层HA-1800屏障模型为124Ωcm2。FLU透过率测定结果显示:单层hBMEC屏障模型为67.8%,共培养屏障模为42.6%。

而后,我们利用实验室现有的猪链球菌2型强毒株ZY05719对比大肠杆菌DH5α、猪链球菌CHz型强毒株CZ130302对比其基因缺失弱毒株50K进行体外血脑屏障穿透试验,统计结果显示:猪链球菌2型强毒株ZY05719对三种屏障模型穿透能力强于大肠杆菌DH5α且差异显著,大肠杆菌DH5α在4h内甚至无法对共培养屏障模型完成穿透。

而猪链球菌CHz型强毒株CZ130302对三种屏障模型的穿透能力都强于50K且差异显著。以上几点说明我们构建的三种血脑屏障细胞模型不仅能够形成与体内生理条件下相似的结构、具有一定的限制物质透过能力,还对致脑膜炎细菌有一定的屏障能力,可以体现出不同细菌对屏障模型穿透能力的差异。但在跨内皮阻抗（TEER）方面与其他文献指报道还存在差异。本研究在细胞共培养模拟体内血脑屏障基础上使用猪链球菌穿透血脑屏障致脑膜炎的研究结果在国内报道较少。这一模型不仅为研究猪链球菌与构成血脑屏障的细胞间互相作用搭建了体外可视化平台还为其提供了一定的理论支持。