HBVSMC人脑血管平滑肌细胞的培养操作说明！

一、细胞简介

血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。最新研究表明血管平滑肌细胞表达的 ICAM-1 和 VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关。人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息。

二、产品信息

平台编号：Bio-133556

规格：1×10^6cells/T25培养瓶

细胞信息：HBVSMC

细胞名称：人脑血管平滑肌细胞

产品类别：人源细胞系

生长特性：贴壁生长

培养体系：DMEM（高糖）+10S

传代方法：1:2传代

细胞形态：上皮细胞样

冻存条件：无血清细胞冻存液

保存条件：95％（ViabilitybyTrypanBlueExclusion）  

传代方法：1:2传代  

传代情况：2~3天换液  

培养体系：温度：37；气相：空气，95%；CO2，5%  

细胞描述：本库的细胞仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞转让给第三者。  

冻存条件：完全培养基50%+40S+10%DMSO，液氮  

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

三、细胞培养说明

注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。

经过以下步骤后开始培养细胞

1、准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。向T-75瓶内加入10ml无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)

2、准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。

3、用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20ml完全培养基。将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。

4、将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。用1mleppendorf吸管轻轻重悬管内容物。

5、将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。推荐接种密度为5,000cells/cm2。

注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。

6、盖好盖子，轻轻地摇晃培养瓶以使细胞分布均匀，如需气体交换则打开瓶盖。

7、将培养容器放入培养箱中。

8、为了得到良好的结果，在培养开始后至少16个小时内不要动培养物。第天天更换培养基以去除残留的DMSO和未贴壁的细胞，然后每隔一天进行如上操作。培养良好的细胞将呈现纺锤体形，通常细胞呈均匀的丛状或板状而不是单个分散的细胞，并且细胞数量在培养2-3天后会加倍。

四、维持培养

1、从冰冻的细胞构建培养物后，第二天早晨更换新鲜的含有添加物的培养基。随后的传代培养中，每隔48小时更换一次培养基。

2、每隔一天更换一次培养基，直到细胞有50%融合。

3、一旦细胞达到50%融合，则要每天更换培养基直到细胞大约达到90%融合。

五、传代培养

1、细胞达到90%融合时需传代培养。

2、准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2)。

3、加执培养基，胰酶/EDTA消化液，胰酶中和液和DPBS(磷酸盐缓冲液)到室温。我们不推荐在使用前用37°C水浴加热试剂和培养基。

4、用DPBS冲洗细胞。

5、用10ml胰酶/EDTA消化液消化细胞(以T-75培养瓶为例)。直到80%细胞呈圆形(在显微镜下观察)。立刻加入10ml胰酶中和液并轻轻摇晃培养瓶。

6、收取细胞并将其移入50ml离心管中。另外用10ml生长培养基冲洗培养瓶以收集残留的细胞。在显微镜下观察剩余细胞数量以确定是否收集成功。剩余细胞数应小于5%。

7、以1000转离心收取的细胞5分钟，然后在生长培养基中重悬细胞。

8、细胞计数然后将它们接种到新的，多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，细胞密度以推荐数值为准。

六、注意

处理人类来源的产品存在潜在的风险。尽管每一株细胞都经检测艾滋病毒，乙肝病毒，丙肝病毒呈阴性，检测不能达到100%准确，因此，必须采取适当的保护措施避免无意的暴露。操作这些产品时要带手套和安全镜。不要用嘴吸。我们推荐以下通用的程序来处理人类来源的产品，从而以最小的预防来对抗污染。