THP-1 人白血病细胞的复苏与传代及其应用！

 

一、背景

 

THP-1人白血病细胞是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液，有分化为多种巨噬细胞的能力，是各领域研究常用的细胞系之一。

 

THP-1是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者。属于悬浮细胞，适合用于转染或感染实验。其表面抗原HLA型为：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。

 

二、细胞复苏

 

1、预热水浴锅至37

 

2、准备一个15mL离心管，加入2-3mL左右完全培养基待用

 

3、将细胞从-80冰箱或液氮中取出后，放进一次性PE手套中，立即投入水浴锅，迅速用力摇晃管子，使其1分钟内融化

 

4、酒精擦拭冻存管，进入生物安全柜，把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中

 

5、1200rpm（约250g）离心3分钟

 

6、同时准备1个新的T25培养瓶，加入5mL完全培养基

 

7、去上清，新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6的培养瓶里，放入培养箱

 

三、细胞冻存

 

1、预先配制好冻存液

 

2、细胞1200rpm（约250g）3分钟离心后

 

3、去上清，用配好的冻存液重悬细胞

 

4、转移入冻存管

 

5、冻存管放进程序冻存盒

 

6、冻存盒放进-80度冰箱过夜，再放液氮长期保存

 

四、培养条件

 

培养基：RPMI-1640+10S+0.05 mMβ-mercaptoethanol+1%P/S

 

推荐传代比例：1:3-1:6，每2-3天换液一次

 

培养条件：气相：95%空气+5%CO2，温度：37

 

五、传代操作

 

当细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时，即可进行传代。由于是悬浮细胞，可直接将细胞吸出，离心之后传代。传代最少浓度不应少于1x10^5 cells/ml。

 

去掉培养皿中的培养基，加入PBS进行冲洗，并去上清;

 

加入胰酶进行润洗，并去上清;

 

放入CO2培养箱消化2-4min;

 

加入完全培养基终止消化，并吹打均匀。

 

六、应用

 

用于白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）固有免疫应答机制的初步研究：

 

白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）产生前炎症因子的初步研究目的研究白念珠菌对THP-1细胞分泌TNF-α、IL-6等前炎症因子的影响。

 

方法：实时荧光定量PCR分析不同浓度（105 CFU/ml.106 CFU/ml）灭活白念珠菌。脂多糖（LPS）刺激THP-1细胞后TNF-α、IL-6的mRNA表达水平变化；并以酶联免疫吸附法检测THP-1细胞与106 CFU/ml灭活白念珠菌、LPS共培养后TNF-α、IL-6的分泌量。

 

结果：105 CFU/ml白念珠菌组、106 CFU/ml白念珠菌组、阳性刺激物脂多糖（LPS）刺激THP-1细胞组以及空白对照组的TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达水平进行双因素方差分析,结果显示不同组别的TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达水平有差异（F=110.983,P<0.001；F=294.114,P<0.001）；刺激1、3、6h之间也有统计学意义（F=701.680,P<0.001;F=1036.557,P<0.001）;

 

提示：在6h内白念珠菌上调TNF-αmRNA、IL-6 mRNA水平随时间延长而增高,且白念珠菌组上调TNF-αmRNA、IL-6 mRNA水平表现为剂量依赖效应。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌组、LPS组、培养基对照组的上清液中TNF-α蛋白浓度分别为（6385.70±533.99）ng/L、（3212.06±353.00）ng/L、（147.10±0.53）ng/L,三者之间差异有统计学意义（n=8,F=71.25,P<0.01）,白念珠菌组、LPS组分别与培养基对照组比较,TNF-α蛋白分泌量均明显升高,差异有统计学意义（P分别为<0.01、<0.05）。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌组、LPS组、培养基对照组的上清液中IL-6蛋白浓度分别为（924.90±30.13）ng/L、（286.10±6.12）ng/L、（10.47±0.07）ng/L,三者之间差异有统计学意义（n=8,F=61.27,P<0.01）,白念珠菌组、LPS组分别与培养基对照组比较,IL-6蛋白分泌量均明显升高,差异有统计学意义（P分别为<0.01、<0.01）。

 

结论：THP-1细胞体外与白念珠菌作用后分泌TNF-α、IL-6水平明显增高,且呈现剂量依赖效应与时间依赖效应,从而参与抗念珠菌感染固有免疫反应。第三章白念珠菌诱导活化人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）信号通路的初步研究目的探讨白念珠菌对THP-1细胞内信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF-κB）激活的影响。方法免疫印迹法分析106 CFU/ml灭活白念珠菌体外作用THP-1细胞30min、1h后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平及IκBα和磷酸化IκBα的水平。

 

以106 CFU/ml灭活白念珠菌菌悬液、LPS刺激THP-1细胞后,以免疫荧光法观察NF-κB核转位。同时设置地塞米松抑制组,以同样的方法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平；并以实时荧光定量PCR法检测地塞米松预处理后THP-1细胞TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达水平的变化。

 

结果：106 CFU/ml白念珠菌作用于THP-1细胞30min、60 min后磷酸化p38MAPK、磷酸化IKBa蛋白水平明显升高。培养基对照组中,p65处于细胞质内；白念珠菌及LPS诱导刺激后,核内出现p65。地塞米松抑制组可降低白念珠菌对磷酸化P38MAPK的激活水平。40 gg/L地塞米松预先与THP-1细胞共培养30 min后,再以106 CFU/ml白念珠菌刺激6 h检测TNF-αmRNA表达水平（3.77±0.62）较未用地塞米松组（208.50±10.50）明显降低,IL-6 mRNA表达水平（12.66±1.63）较未用地塞米松组（584.43±16.80）明显降低。地塞米松可阻断白念珠菌上调TNF-αmRNA、IL-6 mRNA表达水平。