人磷酯酶C(PLC)ELISA 试剂盒的应用！

 

一、背景

 

人磷酯酶C(PLC)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本磷酯酶C(PLC)含量。

 

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中磷酯酶C(PLC)水平。用纯化的磷酯酶C(PLC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酯酶C(PLC)，再与HRP标记的磷酯酶C(PLC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酯酶C(PLC)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中磷酯酶C(PLC)浓度。

 

二、准备试剂与收集血样

 

1、收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8保存48小时；更长时间须冷冻（-20或-70）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。

 

2、标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成2 0 000U/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入2000 0 U/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

 

3、10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

 

4、洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

 

三、检测程序

 

1、加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37120分钟。

 

2、洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

 

3、每孔中加入第一抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置376 0分钟。

 

4、洗板：同前。

 

5、每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置373 0分钟。

 

6、洗板：同前。

 

7、每孔加入底物工作液100ul，置37暗处反应15分钟。

 

8、每孔加入100ul终止液混匀。

 

9、30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

 

四、结果计算与判断

 

1、所有OD值都应减除空白值后再行计算。

 

2、以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 U/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

 

3、根据样品OD值在该曲线图上查出相应OLab含量，再乘上稀释倍数1 0即可。

 

五、应用

 

人磷酯酶C(PLC)ELISA试剂盒用于CNP介导的PKG/PKA-PLCβ通路在糖尿病大鼠胃动力障碍中的作用研究：

 

在糖尿病大鼠模型上探讨糖尿病胃动力障碍发生发展过程中胃平滑肌中磷酯酶Cβ亚型（PLCβ）活性变化及其作用机制,阐明C型钠尿肽（CNP）通过环磷酸鸟苷（cGMP）和环磷酸腺苷（cAMP）,激活蛋白激酶G（PKG）和蛋白激酶A（PKA）从而改变PLCβ-三磷酸肌醇（IP3）通路,以及该通路在糖尿病胃动力障碍发生发展中的重要作用。

 

方法：本实验选用的动物为Wistar大鼠（雌雄不限,体重180-220g）。通过腹腔单次注射链脲佐菌素（STZ,65mg/kg）制造糖尿病模型;应用离体肌条实验技术检测了CNP的胃窦平滑肌自发性收缩的作用;利用免疫组织化学技术和蛋白质免疫印迹技术测定正常对照组及糖尿病组PLCβ3和PLCβ1蛋白的含量变化以及PLCβ33S1105的磷酸化水平以及CNP、KT5823（PKG阻断剂）和H-89（PKA阻断剂）的对PLCβ3S1105的磷酸化水平的影响作用;应用酶联免疫吸附法测定了正常对照组和糖尿病组中IP3含量的变化及CNP、KT5823和H89对IP3含量的影响。

 

结果：

 

1、与正常对照组相比,糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织中PLCβ3、PLCβ1的表达量明显减少（n=9,P＜0.05）。

 

2、与正常对照组相比,糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织中PLCβ3S1105的磷酸化明显增多,PLCβ3活性明显降低（n=9,P＜0.05）。

 

3、CNP对正常组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌自发性收缩运动均有抑制作用,且从收缩振幅抑制程度、收缩频率抑制程度、收缩完全抑制时间、基础张力四个方面对比,CNP对糖尿病组的抑制作用明显大于正常对照组（n=8,P＜0.05）。

 

4、在糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织中,IP3含量明显低于正常对照组（n=8,P＜0.05）,加入CNP能明显降低大鼠胃窦平滑肌组织中的IP3含量,这种作用在糖尿病组中更明显（n=8,P＜0.01）。

 

5、在糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织中,同时阻断PKG和PKA,CNP降低IP3含量的作用几乎被抵消（n=8,P＜0.05）。

 

6、在糖尿病大鼠胃窦平滑肌中,CNP能够促使PLCβ3S1105的磷酸化（n=9,P＜0.05）,从而抑制PLCβ3的活性,而同时抑制PKA和PKG能够阻断CNP对PLCβ3S1105的磷酸化作用（n=9,P＜0.05）。

 

结论：在糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织中,CNP能够通过PKG和PKA通路促使PLCβ3S1105的磷酸化,降低PLCβ3的活性,并进一步减少胃平滑肌细胞IP3的生成,从而抑制胃窦平滑肌自发性收缩。