小鼠骨髓巨噬细胞的运输和保存及应用！

一、背景

小鼠骨髓巨噬细胞是取自小鼠骨髓的巨噬细胞，主要用巨噬细胞的体外培养研究实验。巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，并且由于其强大的吞噬病原微生物活性，它们是抵御外来入侵者的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官，肝脏，肺，胃肠道，中枢神经系统，骨骼和皮肤中。由于他们的重新分配，参与了广泛的生理和病理过程。

巨噬细胞是高度通用的细胞，能够识别微环境改变并维持组织稳态。许多病原体已经进化出通过巨噬细胞作为特洛伊木马来生存，复制、感染人类和动物并在全身繁殖的机制。最近对进化、遗传、宿主-病原体相互作用的生化方面重新引起了对巨噬细胞的广泛关注。

从小鼠组织中分离常驻巨噬细胞产率低且程序复杂，这对于许多功能性巨噬细胞的获得和研究来说困难重重，同时需要大量相对均一的细胞。这些都制约了原代巨噬细胞的相关研究。而一种重要且有效的替代方法就是用适当的生长因子在体外培养骨髓细胞，以此从骨髓前体细胞分化成大量巨噬细胞。但是制备小鼠骨髓来源的巨噬细胞存在操作复杂，制备率低，涉及试剂较多和周期长等制备问题。

小鼠骨髓来源的巨噬细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)或l929上清(含巨噬细胞集落刺激因子)等存在下，对未分化的骨髓细胞进行体外分化获得的原代巨噬细胞，特别可以从转基因小鼠品系中获得相应的转基因小鼠原代巨噬细胞。因此，是广泛应用于免疫学和细胞生物学中体外研究中的优秀模型。

二、细胞特性

1)组织来源于实验动物的正常骨髓组织。

2)细胞鉴定：CD68或MAC387免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：圆形，不规则细胞，贴壁培养。

三、产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

四、产品使用

1)本产品仅能用于科研

2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核

3)本产品未通过用于活体诊断的审核

四、应用

用于PDK1靶向AKT调控小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的机制研究：

PDK1对RANKL和MCSF诱导的小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化产生的影响,探索一条新的破骨细胞分化调控通路,有助于深入了解和认识破骨细胞相关骨质疏松症发生的分子生物学调节机制。

方法：(1)提取及培养C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞,破骨细胞诱导分化培养液连续诱导培养小鼠骨髓巨噬细胞6天,每天镜下观察破骨细胞生长情况及形态学变化,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)鉴定破骨细胞并计数;

(2)破骨细胞诱导分化培养液分别诱导培养小鼠骨髓巨噬细胞0、2、4、6天,培养液中不含RANKL为对照组,两组分别在细胞培养的第0、2、4、6天分别提取细胞总RNA和总蛋白,实时荧光定量PCR检测PDK1mRNA的表达情况,BCA试剂盒测定蛋白浓度,免疫印迹法检测PDK1、AKT蛋白的表达及其磷酸化情况;

(3)Negative Control siRNA转染小鼠骨髓巨噬细胞,按照siRNA:lipofectamin2000为1:0.01-1:0.1(pmol:ul)比例范围寻找转染小鼠骨髓巨噬细胞siRNA的最佳浓度并计算转染效率;

(4)设计合成三条PDK1-si RNA并分别转染小鼠骨髓巨噬细胞,转染48h后,提取各组(空白组、Negative Control siRNA组、PDK1-siRNA-1组、PDK1-siRNA-2组和PDK1-siRNA-3组)细胞的总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR检测各组PDK1 mRNA的表达情况,蛋白印迹法检测各组PDK1蛋白的表达情况;(5)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测PDK1-si RNA对小鼠骨髓巨噬细胞增殖能力的影响。