RKO人结肠腺癌细胞的应用及培养步骤！

一、背景

RKO人结肠腺癌细胞是一个低分化的结肠癌细胞系。RKO细胞含有型P53，但缺乏人甲状腺受体核受体(h-TR beta 1)。RKO细胞的P53蛋白的水平高于RKO-E6细胞。RKO细胞系是RKO-E6和RKO-AS45-1的亲本细胞系。该细胞系在裸鼠中成瘤，且在软琼脂中形成集落。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于苦杏仁蛋白提取及其对人结肠腺癌细胞生长影响研究：

以苦杏仁蛋白为研究对象,用碱溶酸沉法、分离蛋白法、盐析法、反胶束法及盐碱两步法等五种方法从苦杏仁中提取蛋白,通过测定蛋白含量、蛋白提取率以及蛋白组成成分,分别在蛋白含量、提取率及组成蛋白种类等各层面,确定较理想的苦杏仁蛋白提取方法,并分析苦杏仁蛋白组成成分。

将用不同方法提取的苦杏仁蛋白应用于细胞增殖分析试验,研究苦杏仁蛋白对人结肠腺癌细胞生长的影响,并初步分析具有抑制该细胞生长的苦杏仁蛋白结构。主要结果如下：

1)以苦杏仁为原料,用碱溶酸沉法、分离蛋白法、盐析法、反胶束法及盐碱两步法等五种不同方法分别提取苦杏仁蛋白,通过用凯氏定氮法测定蛋白含量,分析蛋白提取率,结果表明用盐析法提取的苦杏仁蛋白含量最高,用盐碱两步法提取的苦杏仁蛋白提取率最高。

2)用凝胶过滤层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及提取具有不同溶解性蛋白组分等方法,分析用上述五种不同方法提取的苦杏仁蛋白的组成成分,结果显示用盐析法提取的苦杏仁蛋白中所含蛋白种类最多。

3)用凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究用上述五种不同方法提取的苦杏仁蛋白成分,结果表明苦杏仁蛋白是由相对分子量为22 KDa到63 KDa之间的不同亚基以不同方式组成,用不同提取方法提取的苦杏仁蛋白中所含蛋白种类有所不同。

4)按溶解性不同从苦杏仁中提取清蛋白,球蛋白,醇溶蛋白,谷蛋白,结果表明苦杏仁蛋白中包含清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其所占百分比分别约为75%、14%、6%和5%。

5)利用细胞增殖分析试验,研究用上述五种方法提取的苦杏仁蛋白对人结肠腺癌细胞生长的影响,结果发现用反胶束法提取苦杏仁蛋白具有显著抑制人结肠腺癌细胞生长作用,该作用具有浓度依赖性。

6)研究按不同溶解性提取的苦杏仁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白对人结肠腺癌细胞生长的影响,结果表明苦杏仁中醇溶蛋白和谷蛋白分别具有显著抑制人结肠腺癌细胞生长作用,该作用也同样具有浓度依赖性。

7)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析苦杏仁中醇溶蛋白和谷蛋白结构,结果表明醇溶蛋白显示相对分子量为43 KDa、40 KDa、31 KDa、23 KDa、15 KDa、14 KDa这6条泳带,谷蛋白为40 KDa、31 KDa、23 KDa、15 KDa、14 KDa这5条泳带。经过测定蛋白含量,结果表明两者均为结合了其它非蛋白分子的蛋白复合物。