人空泡毒素相关蛋白A(VACA)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

人空泡毒素相关蛋白A(VACA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人空泡毒素相关蛋白A（VacA）的含量。

二、实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人空泡毒素相关蛋白A（VacA）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人空泡毒素相关蛋白A（VacA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

三、样本处理及要求

1、血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-81000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

3、组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。

四、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3、样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

5、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

7、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

五、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

六、应用

用于幽门螺杆菌CagA及VacA等位基因型与消化性疾病的相关性探讨研究：

评估江苏地区幽门螺杆菌（Hp）毒素相关蛋白基因（CagA）的状态及空泡毒素相关基因（VacA）的不同基因亚型（s1/s2,i1/i2,m1/m2）与临床疾病之间的相关性。

方法：取行内窥镜检查患者的胃黏膜组织，进行细菌学培养及组织病理学检查。同时取内镜下诊断为胃癌患者的胃癌组织。提取培养成功的151例细菌的DNA及42例胃癌组织的DNA,PCR方法检测CagA及VacA基因的不同基因型。结果：共成功检测193例Hp的基因型，其中CagA阳性占95.9%（185/193），VacA s1型占96.4%（186/193），VacA i1型占97.4%（188/193），m2型占59.1%（114/193），m1型占39.4%（76/193）。CagA的状态及Hp VacA s、m、i等位基因型在慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌中的检出率无明显统计学差异（P＞0.05），各种基因型与胃黏膜萎缩或肠化的发生均无明显相关性（P＞0.05）。185例CagA阳性株中有180例（97.3%）CagA3’端重复区由相同的两个重复区构成，限制了发现其多态性与临床疾病以及病理学转归的相关性。结论：江苏地区Hp的优势基因型为CagA+/VacAs1i1m2，未发现Hp CagA及VacA s、m、i等位基因与临床疾病存在显著相关性。

幽门螺杆菌（Helicobater pylori，H.pylori,Hp）感染在胃部分切除术后消化性溃疡复发和残胃癌的发生机制中起着一定的作用。因此，诊断这部分人群有无Hp感染十分重要。本文的主要目的是讨论常用的几种检测Hp感染的方法诊断胃部分切除术后病人Hp感染的效率。