HUVEC细胞的背景与应用及实验操作步骤！

一、背景

HUVEC细胞是采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用胶原酶型用消化分离得到脐静脉内皮原代细胞。胶原酶是最理想的血管内皮细胞分离酶，对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。

二、实验步骤

1、将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。（注：4下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）

2、用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3、用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4、消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5、将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6、倒去上清，加入10ml M199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37培养。（注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）

7、培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 ml新鲜的M199培养基。

8、以后每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。

9、一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10、倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1TA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11、用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml无菌离心管中，2000转/分，离心3分钟。

12、倒掉上清，加入10ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代3-4瓶，以后照此传代培养。

13、一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。

三、应用

用于Leukamenin E诱导HUVEC细胞K8/18磷酸化引起角蛋白网络组装抑制的研究：

以对映-贝壳杉烷型二萜化合物leukamenin E为受试药物,用人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）和人胰腺癌细胞（Pancreatic cancer cells,Panc-1）为受试细胞株,通过MTT法、AO/EB双染法、间接免疫荧光技术、western bloting（WB）技术、transwell方法和划痕法研究了leukamenin E对细胞角蛋白纤维的影响,首次发现leukamenin E可通过ERK信号途径诱导角蛋白纤维磷酸化,阻滞角蛋白纤维组装进程。

主要结果如下：

1、MTT法和AO/EB双染法结果显示,2-4μmol/L的leukamenin E处理HUVEC及Panc-1细胞24 h后,2种细胞的增殖效应均被显著抑制,并伴有浓度依赖性;但并不会引起显著的凋亡及坏死效应。为后续研究建立适合的浓度体系,以排除细胞凋亡引起的细胞骨架降解。

2、直接荧光染色和间接免疫荧光检测发现:在已铺展完成的细胞内以及在铺展进行中的细胞内,使用微丝解聚药物（细胞松弛素B）和微管解聚药物（秋水仙素）充分解聚微丝和微管后,HUVEC细胞的角蛋白纤维网络仍维持完整,表明该细胞的角蛋白纤维网络适用于筛选靶向角蛋白纤维组装的药物。

3、直接荧光染色和间接免疫荧光检测发现:在已铺展完成的细胞内,2μmol/L和4μmol/L的leukamenin E可显著减少HUVEC细胞的角蛋白纤维数量,但几乎未减少微丝和微管的数量;对于铺展进行中的细胞,leukamenin E可显著减少HUVEC细胞的铺展面积,并阻滞其角蛋白纤维网络的组装。进一步的WB检测发现,HUVEC细胞质中可溶性角蛋白纤维增加,而非可溶性角蛋白纤维减少,这表明leukamenin E可能通过增加角蛋白纤维可溶性,抑制了角蛋白纤维网络的形成。

4、WB检测到,在已铺展细胞内,leukamenin E能够浓度依赖性地激活角蛋白K8-Ser431/Ser7及K18-Ser52位点的磷酸化;在铺展中细胞内,leukamenin E显示了浓度和时间依赖性地增加角蛋白K8-Ser431/Ser7及K18-Ser52位点的磷酸,其中pK8-Ser431升高的时间早于pK8-Ser73及pK18-Ser52。这表明3个位点的磷酸化可能导致了角蛋白纤维可溶性增加。间接免疫荧光双染实验进一步验证,发现角蛋白纤维网络上定位的pK8-Ser431、pK8-Ser73和pK18-Ser52相比于K8及K18有所减少,同时WB还检测到,HUVEC细胞质中可溶性的pK8-Ser431、pK8-Ser73和pK18-Ser52角蛋白纤维增加,而非可溶性pK8-Ser431、pK8-Ser73和pK18-Ser52减少。这证实了leukamenin E表明诱导的pK8-Ser431、pK8-Ser73和pK18-Ser52升高与角蛋白纤维的可溶性增加相关联。

5、WB检测表明:leukamenin E能够升高ERK磷酸化;联合使用ERK抑制剂后,发现K8-Ser431位点、K8-Ser73位点18-Ser52位点的磷酸化现象能够被抑制,并且无论在已铺展还是铺展中体系中,被leukamenin E处理后,上清液中的角蛋白显著增多以及沉淀中的角蛋白明显减少的现象均能够被ERK抑制剂所抑制;表明ERK信号通路与leukamenin E诱导的pK8-Ser431、pK8-Ser73和pK18-Ser52升高相关联。

6、通过transwell和划痕实验表明:leukamenin E能够显著抑制HUVEC细胞和Panc-1细胞的迁移能力;综上所述,leukamenin E在对HUVEC细胞的增殖抑制体系下,leukamenin E能够通过ERK途径使得角蛋白在K8-Ser73/Ser431和K18-Ser52位点上发生磷酸化,增加了胞质中可溶性的pK8-Ser73/Ser431,pK18-Ser52和泛角蛋白,很可能进一步导致了细胞中角蛋白纤维组装的阻滞作用。