人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)ELISA KIT的应用！

 

一、背景

 

人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)ELISA KIT用于测定血清、血浆及相关液体样本中人血清淀粉样蛋白A3(SAA3)的活性及含量。

 

实验原理：用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

 

二、样品收集、处理及保存

 

1、细胞培养上清:

 

适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液,以1000×g离心15分钟,收集上清。

 

2、细胞:

 

用PBS反复洗涤细胞3次,调整细胞浓度达到104-106/ml左右,通过反复冻融,使细胞破坏并放出细胞内成份,或者细胞超声粉碎,离心取上清液检测。

 

3、血清:

 

在室温下,血液自然凝固,以1000×g离心15分钟,取上清待测。

 

4、血浆:

 

应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合后静置10-20分钟后,以1000×g离心15分钟,收集上清。

 

三、操作步骤

 

1、取出试剂盒,室温(20-25)放置30分钟。

 

2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照

 

3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。

 

4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

 

5、温育:用封板膜封板后置37温育30分钟。

 

6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。

 

7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。

 

8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37恒温孵育1小时。

 

9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。

 

10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。

 

11、终止:25-37下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。

 

12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。

 

注:读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹,读板时间控制在终止反应后的30分钟内,以免影响准确性。

 

四、数据计算

 

以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。

 

五、应用

 

用于猪血清淀粉样蛋白3对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响研究：

 

血清淀粉样蛋白3（Serum amyloid A3,SAA3）是干扰素诱导蛋白,也是机体感染的指标分子之一。但是,PRRSV感染过程中猪SAA3的变化及其对PRRSV复制的影响尚不清楚。

 

研究分析了PRRSV感染中SAA3的变化以及对PRRSV复制的影响,以期为研究PRRSV感染机制提供帮助。根据猪SAA3的全基因序列设计特异性扩增引物,扩增猪SAA3的开放阅读框区域。将扩增的基因的片段连接到Flag7.1空载体构建真核表达载体。将猪SAA3的氨基酸序列分别与人和小鼠的SAA家族序列进行比对,阐明猪SAA3蛋白的分子生物学特性和系统进化关系,并以此为依据合成猪SAA3抗原小肽,用于制备SAA3多克隆抗体。将合成的猪SAA3抗原小肽免疫兔制备多抗血清,并用ELISA方法检测多抗血清效价,利用Western-blot以及间接免疫荧光技术检测多抗血清的特异性和灵敏性。

 

结果显示,制备的多抗血清可以特异性识别猪源的SAA3蛋白。为了检测PRRSV感染过程中,PAM细胞以及猪各个组织中SAA3的RNA水平和蛋白水平的变化。将PRRSV感染PAM细胞,在不同时间点提取RNA,用相对荧光定量PCR的方法检测SAA3 mRNA的动态变化。将PRRSV感染30日龄SPF猪,收取各个组织,分别在RNA和蛋白水平检测SAA3的变化。

 

结果显示,在PAM细胞中,接毒组在12小时以后,SAA3 mRNA水平明显高于对照组。在猪各个组织中,接毒组各组织SAA3 mRNA水平都有不同程度的升高,其中肺脏升高最为明显,约是对照组的200倍。Western-blot结果发现,接毒组的肺脏、肾脏等的SAA3蛋白水平明显高于对照组,说明PRRSV感染时SAA3在机体各组织的表达会产生明显差异。为了研究猪SAA3蛋白对PRRSV感染的影响,利用过表达猪SAA3以及外源加入SAA蛋白的方法来检测SAA3对PRRSV复制的影响。荧光定量PCR结果显示,过表达猪SAA3能够显著提高PRRSV mRNA复制水平。

 

TCID50的结果表明,猪SAA3表达组的PRRSV滴度显著高于空载体对照组。分析SAA对病毒感染阶段的影响发现,外源加入SAA蛋白能够促进病毒对宿主细胞的吸附作用。

 

综上所述,本研究对猪SAA3进行了克隆、表达和抗体制备,分析了PRRSV感染对猪SAA3表达的影响及其生物学意义,发现了PRRSV可上调猪SAA3表达,SAA3能够促进PRRSV病毒复制和宿主细胞的吸附。