小鼠肾小管上皮细胞的生物学特性与实验方法！

一、背景及概述

目前很多学者认为，“马兜铃酸肾病”(aristolochicacidnephropathy，AAN)引发的肾间质纤维化病变的主要机制很可能是肾小管上皮细胞转分化异常所致。因此，培养肾小管上皮细胞(RTECs)并建立其模型，对肾间质纤维化机制的深入研究具有重要的意义。此外，心脏疾病严重威胁人类健康，与其紧密关的肾脏机能成为当今研究的热点，建立小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)原代培养细胞模型，对进一步阐明心脏疾病的发病机制和治疗药物筛选的研究具有重要意义。目前，体外培养mRTECs更多地应用于肾间质纤维化的研究和筛选相关治疗药物，得到稳定的mRTECs细胞株，这些细胞株的建立大部分经过基因转染技术，使其在结构和功能等方面与体内正常的mRTECs有着根本的差别，而原代细胞培养具有细胞性质更接近体内细胞状况的独特优势，基本上没有一种细胞系能够保持原代细胞的基本特征。因此，需要建立高效的RTECs原代细胞培养技术。常用的原代培养方法有显微解剖分离酶消化法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分离法等，RTECs常常很难获得而且价格昂贵，条件要求也非常苛刻。

二、生物学特性

有研究采用3种指标即细胞生长曲线、细胞增殖(MTT法)、DNA周期流式细胞仪检测来反映mRTECs的生长增殖能力。通过细胞计数法绘制P1、P3、P5细胞生长曲线，结果显示P1、P3代mRTECs生长曲线近似“S”形，潜伏期约2d，可能是细胞重新贴壁生长时对新环境有一个适应过程；2d后进入对数生长期，此时细胞迅速增殖，可以用于实验；6d后进入停滞期，细胞数量大且细胞分裂近乎停止，此时已经进入衰老期，细胞处于生长抑制期，不能应用于实验，因此，最好不要超过7d进行传代，P5代细胞无增殖且逐渐凋亡，此时已经进入衰退期，mRTECs在体外培养传代次数有限且3代内的细胞可用于实验。

MTT法检测P1、P3、P5mRTECs增殖活力结果显示，P1、P3细胞光密度值(A490nm)在细胞传代后4～6d变化较快，表明此时间内mRTECs增殖力较强，P5mRTECs体外培养几乎无增殖。从上述结果可以得出，P3以内的mRTECs在体外传代3～4d可作为理想的实验细胞，与生长曲线一致。细胞周期内有2个阶段最为重要：G1期到S期和G2期到M期；从光学显微镜下可看到G1期细胞最小，细胞扁平而光滑，随着向S→G2→M期的发展，细胞逐渐增大，从扁平变成球形。研究通过对体外培养的P1、P3mRTECsDNA周期检测结果显示，G0/G1的比值达80%，(S+G2)/M细胞比值接近20%，体外传代增殖潜力基本一致，均可获得稳定的细胞培养方法，将对深入了解的细胞体外生长特性具有重要意义。

三、培养方法与步骤

1、肾小管节段的分离和提取

小鼠实验前12h禁食，自由进水。颈椎脱臼处死后无菌取肾，去肾蒂及包膜后置于80目不锈钢网筛上，剪碎、研磨后用培养液充分冲洗，收集液体，经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾小管节段，充分吹吸后，等量分装于4只10m1离心管中，800rmin离心5min。4只离心管依次标记为A、B、C、D4组。

2、肾小管上皮细胞的原代培养

离心后弃去上清，A组直接加含有5S的DMEMF12(11)，充分吹吸混匀，镜检后移至24孔培养板内，置CO2培养箱(37、5%CO2)中培养。培养72h时首次换液，以后每2d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞生长情况。B组加1ml0.25%的胰蛋白酶，37消化，每隔3min振荡1次，20min后加等体积含有5S的DMEM/F12培养液终止消化，吹吸后静置5min，0.2%锥虫蓝染色计数。1000rmin离心5min，小心弃上清，加含有5S的DMEMF12充分混匀后，移至24孔板内培养(37、5%CO2)，换液方法及观察同A组。C组加1ml0.25%的胰蛋白酶和0.02TA消化培养，方法同B组。D组加1ml1gL胶原酶消化培养，方法同B组，但48h首次换液，以后每2d换液1次。

3、肾小管上皮细胞的传代培养

原代培养的肾小管上皮细胞培养5～6d基本铺满孔底。吸去培养液，用Hanks液洗涤2次，0.25%的胰蛋白酶37消化；倒置显微镜下观察细胞变圆、少许细胞脱落后，加入完全培养液终止消化；收集细胞悬浮液1000rmin离心5min，加入含5S的DMEMF12完全培养液，以12的比例传代培养。

4、肾小管上皮细胞的鉴定

将培养的肾小管上皮细胞置于放有盖玻片的24孔培养板中，待细胞生长至占培养面积约80%时，取出盖玻片，磷酸盐缓冲液(PBS)洗片。甲醇-20固定5min；PBS洗片；加10%羊血清37封闭30min，PBS洗片；加兔抗人角蛋白18抗体(1200)，阴性对照以PBS代替一抗，37反应1h，PBS洗片；加FITC标记的羊抗兔IgG(1200)，37避光反应45min，PBS洗片；90%甘油封片，荧光显微镜观察染色结果。

5、结果

实验采用的A、B、C、D4种方法比较，B、C两组细胞均难长出，培养初期仅见少量消化细胞存活，难以达到对数生长期；A、D两组细胞均能长出，但D组细胞进入对数生长期(3～4d)比A组早1d，且比组早2d长至80%汇合，镜下细胞形态清楚，呈鹅卵石样，细胞衔接紧密，透明度及折光度良好。因此确定D组方法为最佳细胞培养方法。对D组方法培养细胞的生长和传代情况观察结果，12h贴壁，24h见上皮样细胞从节段周边长出，72h可见大量细胞，在第3～4d进入指数生长期，在第5～6d基本长满；传代细胞第2d贴壁，第3～4d生长良好，第5～6d细胞呈指数性生长，形态为多边形或短梭形，体积较大，衔接紧密，单层生长，镜下透明度及折光性强。细胞长至80%汇合时，以相同的方法传代，其生长周期、细胞形态及镜下折光性变化不大。