人腹膜间皮细胞的复苏与传代及冻存操作说明！

一、细胞简介

人腹膜间皮细胞分离自腹膜组织；腹膜是存在于高等脊椎动物腹腔中的一层黏膜，主要由间皮细胞构成，藉由结缔组织的支持所形成的一层膜状组织。腹膜包覆大部分腹腔内的器官，能分泌黏液润湿脏器的表面，减轻脏器间的摩擦。腹腔脏器的血液、淋巴和神经组织经由腹膜与外界相连；腹膜也具有吸收撞击保护内脏的效果。腹膜(peritoneum)为全身面积最大、配布最复杂的浆膜，由皮及少量结缔组织构成，薄而光滑，呈半透明状。衬于腹、盆腔壁内表面的腹膜称为壁腹膜(parietal-peritoneum)或腹壁薄层；覆盖腹、盆腔器表面的部分称为脏腹膜(visceral-peritoneum)腹膜或腹膜脏层。脏腹膜与壁腹膜互相延续、移行，共同围成不规则的潜在性腔隙，称为腹膜腔(peritoneal-cavity)。腹膜腔是脏、壁两层腹膜之间相互移行围成的潜在性间隙。腹膜腔内有少量浆液，在脏器活动时可减少摩擦。腹膜间皮细胞属于上皮组织中的单层扁平上皮，是覆盖于腹膜表面的一层细胞。间皮细胞是构成间皮的细胞，正常大小约为15-25微米，细胞常呈圆形或者卵圆形。其功用是提供润滑，使器官与器官、器官与胸膜与腹膜间都能得到良好的保护，不会互相磨损受伤。而间皮所生产的润滑和保护作用就是靠间皮细胞所分泌的物质来达成，分泌物多半为细胞外基质、玻尿酸类物质。

二、产品信息

平台编号：Bio-129779

规格：1×10Cells/T25培养瓶

细胞信息：HMrSV5

细胞名称：人腹膜间皮细胞

产品规格：T25培养瓶x1；1.5ml冻存管x2

细胞数量：1x10^6；1x10^6

保存温度：37；-198

运输方式：常温保温运输；干冰运输

安全等级：1

用途限制：仅供科研3类

培养体系：DMEM高糖（HYCLONE SH30022.01)+10S+1%三抗

培养温度：37

二氧化碳浓度：5%

简介：HMrSV5取自女性供体,该细胞为自发永生化细胞系。

注释：倍增时间42h

用途：细胞系

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

三、细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1.从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。

2.从 37水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养基并混匀。

3.操作离心 ， 调至 1000 转/分 ，时长 10 分钟

4.弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞密度，接种培养瓶 ，37培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。

6.注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶中

四、细胞传代操作说明（贴壁细胞）

实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1.细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。

2.按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ，消 化 2min（具体时间视细胞而定），后用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3.注意：消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代）。

五、细胞传代操作说明（悬浮细胞）

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管

实验步骤：

1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。

2.按 T25 培养瓶计，吹打均匀，吸出完全培养基，1000r/min 离心 10 min，弃上清收集细胞，铺至 2 个T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3.注意：原瓶培养基不可继续使用（传代）。

六、细胞冻存操作说明

实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机

实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗 ，DMSO

实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需冻存的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管 ，冻存管 ，记号笔

实验步骤：

1.取待冻存的细胞（按 T25 计 ）用 0.25EDTA 胰酶 2ml 消化 2min ，用完全培养基将细胞冲洗下来。1000r/min 离心 10min ，弃上清收集细胞。 如果是悬浮生长的细胞 ，则可直接离心收集细胞。

2.加入 1ml 冻存液(90S+10%DMSO )制成细胞悬液。

3.细胞悬液装入 3 支冻存管中。

4.冻存管在 4下存放 30 min ，转放-20 1.5～2 h ，再转人-70 4-12 h 后即可转移到液氮内(- 196) ，并登记。