小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)活性及含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）水平。用纯化的小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)，再与HRP标记的小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠晚期糖基化终末产物(AGES)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠晚期糖基化终末产物（AGEs）浓度。

二、样本处理及要求

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

三、操作步骤

1、标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。

2、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3、温育：用封板膜封板后置37温育30分钟。

4、配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7、温育：操作同3。

8、洗涤：操作同5。

9、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37避光显色15分钟.

10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

四、应用

用于晚期糖基化终末产物对糖尿病小鼠角膜树突状细胞的影响及机制研究：

通过体外诱导小鼠骨髓源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）,以及链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导1型糖尿病小鼠模型,探讨晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）对糖尿病小鼠角膜病变中树突状细胞（dendritic cells,DCs）功能的影响及其机制。

方法：

1、AGEs对小鼠BMDCs功能及下游关键信号通路活化的影响。无菌制备小鼠骨髓单细胞悬液,并用IL-4（10ng/m L）和GM-CSF（20ng/m L）诱导成为BMDCs,然后将其随机分为空白对照（CON）组、BSA组和AGE-BSA组,其中BSA与AGE-BSA均按200μg/m L的浓度分别处理BMDCs 12h和24h。通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测IFN-β在上清液内的含量;利用Real-Time PCR（RT-PCR）分析主要炎症相关因子（IFN-β、CXCL10、IFIT1、IL-6、IL-12p35和IL-1β）的表达水平;通过Western blot分析BMDCs中关键信号蛋白TBK1、IRF3和p65的磷酸化水平。

2、糖尿病对小鼠角膜内AGEs及炎症因子表达水平的影响。将雄性C57BL/6小鼠（6周）随机分为正常对照（CON）组及糖尿病（diabetes mellitus,DM）组。DM组为通过腹腔注射STZ诱导的1型糖尿病小鼠。选择成模后6个月的DM小鼠及同周龄的正常小鼠眼球,利用Western blot检测两组小鼠角膜内AGEs的表达水平;利用RT-PCR检测两组小鼠角膜内IFN-β等炎症相关因子的表达水平。

3、cGAS/STING信号通路在AGEs诱导BMDCs活化中的作用。利用IL-4和GM-CSF体外诱导野生型（wild-type,WT）、cGAS及STING基因缺失型（knockout,KO）小鼠BMDCs,并将不同来源的BMDCs随机分为空白对照组和AGE-BSA组。AGE-BSA处理12h后,分别收集BMDCs与细胞上清液。借助ELISA检测不同组别BMDCs上清液IFN-β的浓度;利用RT-PCR检测不同组别BMDCs炎症因子表达情况;借助Western blot分析cGAS/STING通路下游TBK1、IRF3以及p65的磷酸化水平。

4、Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）信号通路在AGEs活化BMDCs中的作用。体外诱导BMDCs,并随机分为空白对照组、AGE-BSA组及TAK-242组（AGE-BSA+TLR4抑制剂TAK-242（5μM））。通过ELISA评估不同组别细胞上清液中IFN-β的浓度;利用RT-PCR检测主要炎症相关因子（同方法1）的转录水平;使用Western Blot分析下游TBK1、IRF3和p65蛋白的磷酸化水平。

5、TLR4信号通路抑制剂TAK-242对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响。将C57BL/6雄性小鼠随机分为以下三组:CON+solvent组（solvent为1%DMSO+99%PBS）、DM+solvent组、DM+TAK-242组（0.375mg/m L）,其中TAK-242于角膜上皮刮除的同时行结膜下注射。使用角膜上皮刮刀和2.5mm环钻刮除小鼠角膜上皮,于刮除后0h、24h和40h行荧光素钠染色照相,并观察角膜上皮愈合的情况。