小鼠脑膜细胞的应用及实验操作方法！

一、背景

小鼠脑膜细胞是分离自小鼠脑膜组织采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁法制备而来，分离的小鼠脑膜细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

脑膜是颅骨与脑间的隔膜，一共有三层，由外向内为硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑膜细胞围绕着大脑，参与中枢神经系统的正常发育，能稳定脑软膜表面的细胞外基质、组织放射状胶质细胞网络和小脑皮层分层结构。

二、细胞操作

1、取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2、贴壁细胞消化

1）吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3）用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4）待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

3、细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原（2-5μg/cm2），多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

三、应用

用于牙龈卟啉单胞菌感染诱导软脑膜细胞和小胶质细胞炎性反应的研究：

研究P.gingivalis和其毒性成分LPS对软脑膜细胞和小胶质细胞的炎性作用,探究P.gingivalis引起脑内神经炎症的相关转导过程,以了解口腔慢性炎症对大脑认知功能的影响。

实验方法：

1、从出生3天的C57BL/6N乳鼠脑中剥离软脑膜组织,提取和培养软脑膜细胞,进行免疫荧光鉴定。培养BV2小胶质细胞。

2、P.gingivalis、P.gingivalis LPS分别刺激软脑膜细胞,CCK-8检测细胞生存能力,Quantitative Real-time PCR、Elisa检测TNF-α、IL-1β、IL-6表达情况。

3、吸取P.gingivalis、P.gingivalis LPS分别刺激软脑膜细胞后的培养液,过滤,刺激小胶质细胞,观察细胞形态变化,CCK-8检测细胞生存能力,Quantitative Real-time PCR、Elisa检测TNF-α、IL-1β及IL-6的表达水平,分析经软脑膜细胞转导的间接作用下,小胶质细胞的炎性反应情况。

4、P.gingivalis、P.gingivalis LPS直接刺激小胶质细胞,观察细胞形态变化,CCK-8检测其生存能力,Quantitative Real-time PCR、Elisa检测TNF-α、IL-1β及IL-6的表达水平,分析直接作用下小胶质细胞的炎性反应情况。

5、细胞免疫荧光染色检测P.gingivalis、P.gingivalis LPS刺激软脑膜细胞后,其p-p38 MAPK的表达水平。

实验结果：

1、细胞免疫荧光鉴定结果显示,原代提取物中软脑膜细胞纯度较高,形态多呈椭圆形、梭形或三角形,突起形态清楚,核大而清晰。

2、P.gingivalis、P.gingivalis LPS可引起软脑膜细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达和TNF-α、IL-6蛋白分泌明显增多,IL-1β由于分泌量未达到检测手段的最大灵敏度,无法检出和分析。软脑膜细胞在此过程中被激活。

3、经P.gingivalis、P.gingivalis LPS刺激后的软脑膜细胞,其培养液可上调小胶质细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达和TNF-α、IL-6蛋白的分泌水平。小胶质细胞呈促炎状态。

4、P.gingivalis及P.gingivalis LPS可直接激活小胶质细胞并引起TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA和TNF-α、IL-6的蛋白表达水平明显升高。在经软脑膜转导后的间接作用途径下,小胶质细胞的炎性反应比直接作用更为强烈。

5、P.gingivalis及P.gingivalis LPS刺激后软脑膜细胞后,p-p38 MAPK的蛋白表达量相比对照组明显升高。

结论：外周P.gingivalis及其毒性成分LPS可经软脑膜细胞介导间接活化小胶质细胞,也可入脑后直接活化小胶质细胞,从而引发小胶质细胞活化依赖性脑炎症,促进AD进展。并且在经软脑膜细胞转导后的间接作用下,小胶质细胞的炎症分泌水平明显比直接作用更高。P.gingivalis及P.gingivalis LPS激活软脑膜细胞并产生促炎因子通过p38 MAPK通路。