人肾实质细胞的背景与使用方法及应用！

一、背景

人肾实质细胞分离自肾组织；肾脏是机体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。肾脏移植是临床上治疗慢性肾功能衰竭的有效方法，然而这种方法受到供体肾短缺的限制。肾细胞移植可部分解决供体肾短缺的问题，是未来可以替代肾脏移植的最有效方法。因此，体外肾细胞的培养受到国内外有关专家的密切关注。

原代肾细胞作为一种常用的肾脏毒理学研究对象，其分离方法主要有机械研磨分离法和酶消化法，酶消化法因对细胞损伤小、分离效果好而优于机械研磨分离法；目前常用的酶消化法主要是胰蛋白酶消化法和胶原酶消化法。

二、使用方法

人肾实质细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈成纤维细胞样，在Procell技术部标准操作流程下，细胞可传3代左右；收到细胞后尽快进行相关实验。

收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1、取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2、贴壁细胞消化

1）吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3）用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4）待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

3、细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原（2-5μg/cm2），多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

三、应用

用于YTHDF1通过上调YAP促进肾纤维化病程的研究：

通过体内外基因敲减和过表达实验来验证生物信息学的结果,即:YTHDF1通过调节YAP参与肾纤维化的进展。

研究方法：

1、本研究首先结合R软件和Perl编程语言分析GEO数据库中的基因芯片数据,将m6A调控因子在人正常对照和纤维化肾脏样本中的表达可视化,并筛选出差异表达的m6A调控因子,即YTHDF1。

2、通过基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）预测纤维化肾脏中YTHDF1与YAP之间的相关性。

3、随后,收集了正常对照组及慢性肾病患者的肾组织样本,采用免疫组化及免疫荧光双标染色检测YTHDF1与YAP在健康和纤维化的人肾组织中的表达及定位。

4、为了进一步研究YTHDF1在肾纤维化中的角色及对YAP的调节作用,本研究构建了单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）、高剂量叶酸（folic acid,FA）和单侧缺血再灌注损伤（unilateral ischemic reperfusion injury,U-IRI）诱导的小鼠肾纤维化模型。

5、结合HE、Masson和PAS染色,以及免疫组织化学染色检测三种肾纤维化模型小鼠在损伤不同时期肾组织的病理和功能改变。

6、基于生信分析结果以及在慢性肾病患者样本中筛选出的YTHDF1,本研究对三种小鼠肾纤维化模型的肾组织样本采用免疫组织化学染色、实时荧光定量、免疫蛋白印迹等手段检测YTHDF1的定位及表达,并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测UUO模型小鼠肾组织的总体m6A水平。

7、体外实验中,构建肾纤维化细胞模型,并通过转染小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默筛选出的YTHDF1,检测沉默YTHDF1前后肌成纤维细胞的标志物（α-smooth muscle actin,α-SMA）,细胞外基质相关蛋白（fibronectin）,以及YAP的表达。

8、体内基因敲减实验,UUO小鼠通过尾静脉注射胆固醇共轭-si RNA方法,抑制YTHDF1的表达,随后采用免疫组化染色、实时荧光定量、蛋白免疫印迹的方法,检测敲减YTHDF1前后UUO小鼠肾脏中YAP在mRNA和蛋白水平的定位及表达。同时,采用HE、Masson染色、免疫组化染色和蛋白免疫印迹的方法,以及血清生化分析,观察敲减YTHDF1前后UUO诱导的模型小鼠肾组织的病理和功能改变,以及α-SMA与细胞外基质相关蛋白（collagen I和fibronectin）的表达。

9、通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验检测YTHDF1与YAP mRNA结合。

10、体外基因过表达实验,检测过表达YTHDF1对α-SMA,fibronectin,及YAP的影响,并在过表达YTHDF1的同时敲减YAP,检测纤维化相关蛋白（α-SMA和fibronectin）的表达。