人脑微血管内皮细胞的背景与应用及培养方法！

一、背景

人脑微血管内皮细胞提取于人脑组织，提取纯化之后立即冻存。细胞通过vWF/Factor VIII和CD31(P-CAM)免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

二、细胞培养方法

1、准备纤维连接蛋白包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。向培养瓶中加入10 ml无菌Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS），然后加入150μl纤维连接蛋白原液(1 mg/ml,Sigma cat.no.F1141)。将培养瓶放入培养箱中孵育过夜。

2、准备完全培养基：用70%的酒精消毒培养基和添加物的外表面，然后放到无菌的地方。在无菌环境下打开每一个添加物管并用吸管将其加入到基本培养基中。以保证添加物全部加入基本培养基中。

3、吸出纤维连接蛋白溶液并向瓶内加入20 ml完全培养基。将培养瓶放入超净台中，然后准备融化细胞。纤维连接蛋白溶液可以使用两次。

4、将小瓶放入37°C水浴中，握住并轻轻旋转小瓶直到其内细胞完全融化。将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹。eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。

5、将管内容物均匀的放入纤维连接蛋白包被的培养瓶中。推荐的接种密度为7,500 cells/cm2。

注意：不推荐在细胞融化后进行稀释和离心，因为这些操作比培养基中的DMSO残留物对细胞的伤害更大。需要注意的是，内皮细胞接种在纤维连接蛋白包被的培养瓶中能够促进细胞的帖壁。

6、盖好培养瓶的盖子，轻轻地摇动培养瓶以使细胞分布均匀，如需气体交换则适当放松瓶盖。

7、将培养瓶放入培养箱中。

8、为了得到良好的结果，在培养开始后至少16个小时内不要动培养物。第二天更换培养基以去除残留的DMSO和未贴壁的细胞，然后每隔一天进行如上操作。培养良好的细胞将呈现鹅卵石形或纺锤体形，细胞质无颗粒且细胞数量在培养2-3天后会倍增。

三、应用

用于塞来昔布对人脑微血管内皮细胞放射后凋亡及释放6-酮—前列腺素F1α、血栓素B2影响研究：

塞来昔布对人脑微血管内皮细胞放射后凋亡影响及其机制研究目的通过培养人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）,观察塞来昔布对于其放射后细胞凋亡改变及其机制。

方法：

1、CCK-8细胞毒性实验确定HBMECs半抑制浓度(IC50),依据IC50确定合适给药浓度进行后续实验。

2、取对数生长期细胞进行实验,细胞分别按空白对照、接受X射线、塞来昔布联合X射线分为对照组（Con）、单纯照射组（IR）、联合组（IR+C）;联合组塞来昔布孵育24h后进行后续实验,照射剂量为8 Gy,实验时间点为照射后6、12、24、48h。

3、克隆形成实验测定HBMECs放射敏感性,计算在塞来昔布作用下其克隆形成率,求出D0、Dq、SF2、SER值,并绘制细胞存活曲线。

4、Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组不同时间点HBMECs的凋亡率。

5、蛋白印迹法（Western blot）检测Cox-2及P-JNK、Cleaved caspase-3的表达情况。

结果：

1、CCK-8细胞毒性实验表明,在塞来昔布作用24h后,10、30、40、50、100μmol/L药物浓度下其抑制率分别为:4.52±0.13%、6.31±0.07%、9.01±0.10%、15.26±0.70%、70.65±0.89%,SPSS19.0软件求得IC50值为81.50±0.75μmol/L,后续实验采用30μmol/L这一亚毒性浓度进行。

2、塞来昔布对HBMECs放射敏感性影响:单纯照射组及联合组均采用多靶单击模型:y=1-（1-exp（-k*x））^N,算出D0、Dq、SF2、SER值。结果表明,在30μmol/L实验浓度下,未观察到塞来昔布放射增敏作用（SER=0.96）。

3、流式细胞术检测塞来昔布对受照后HBMECs凋亡影响结果示,与对照组相比,单纯对照组及联合组细胞凋亡率随时间升高,且差异有统计学意义（p<0.05）;联合组与单纯照射组相比,各时间点凋亡率降低,差异有统计学意义（p<0.05）。

4、Western blot结果所示,对照组HBMECs的Cleaved caspase-3、P-JNK、Cox-2表达量极少,单纯照射组表达量明显增加,且Cleaved caspase-3、Cox-2蛋白表达量随时间延长呈进行性增加;与单纯照射组相比,联合组在受照后各时间点上述蛋白表达均降低。

结论：人脑微血管内皮细胞受照后凋亡率随时间推移而增加,用30μmol/L浓度的塞来昔布处理人脑微血管内皮细胞能降低其受照射后的凋亡率,同时能降低Cleaved caspase-3、P-JNK、Cox-2蛋白的表达,说明30μmol/L塞来昔布对人脑微血管内皮细胞具有放射保护作用,为塞来昔布通过保护血管内皮细胞的途径用于防护放射性脑损伤提供了初步的理论依据,其机制可能是与30μmol/L浓度的塞来昔布通过抑制Cox-2的表达从而影响了Cleaved caspase-3、P-JNK的表达有关。